2019 Fiscal Year Research-status Report
I-BARタンパク質による細胞外小胞産生機構の解明
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19K06639
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| Research Institution | Doshisha University |
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Principal Investigator |
末次 京子 (塙京子) 同志社大学, 研究開発推進機構, 准教授 (40391990)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 細胞外小胞 / シグナル伝達 / 細胞膜 / 細胞間コミュニケーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
I-BARタンパク質は、細胞表面に突起構造を誘導することが出来る脂質膜結合タンパク質である。本研究ではI-BARタンパク質が単に細胞運動時などに見られる細胞表面の突起構造を形成しているのではなく、I-BARタンパク質によって作られた細胞突起が切断されることにより細胞外小胞の生産を誘導している、という新しい細胞外小胞形成を担うタンパク質であることを立証し、これまでにない新たな細胞外小胞形成の分子メカニズムの解明を目的としている。
2019年度は申請書に記載した計画通り、I-BARタンパク質の一つであるIRSp53タンパク質のN末端にGFPを融合させた様々な領域の発現コンストラクトの作成を行った。作成した発現コンストラクトを、培養に血清を必要としないHEK293 free style cellにトランスフェクションし、その培養上精から超遠心分離法により大きさ別にマイクロベシクル画分（直径約1000nm-100nm）とエクソソーム画分 (直径約100nm以下)に分けて精製を行なった。精製した画分を用いてウエスタンブロットを行った結果、IRSp53がマイクロベシクルの生産に寄与していることを示唆する結果を得ることが出来た。
生体内でのIRSp53による細胞外小胞生産メカニズムを調べるためには、IRSp53のノックアウトマウスの解析は必須である。IRSp53は本来致死的遺伝であるが、非常に多くのマウスの掛け合わせによりノックアウトマウスを得ることが出来ることがわかっている。そこで多くの交配を試みることによりIRSp53のノックアウトマウスを得ることに成功した。体液に含まれるマイクロベシクルの解析のため、ノックアウトマウス及びワイルドタイプのマウスから血清を精製しiTRAQ解析を行った。現在、分析結果を精査中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
申請書の計画通り、I-BARタンパク質の一つであるIRSp53タンパク質の様々な領域のフラグメントの発現コンストラクトのを作成し、血清を必要としないHEK293 free style cellを用いて、コンストラクトのトランスフェクション及びタンパク質の発現を成功させることが出来た。これらの実験材料を用いることにより、IRSp53が細胞外小胞産生に大きく寄与することを示唆するデータを得た。またIRSp53のノックアウトマウスより血清を精製し、分析へと進むことが出来た。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度の結果を踏まえ申請書の計画通り、前年度に作成したコンストラクトを用いて、IRSp53による細胞外小胞産生に関与する因子の探索を行なっていく。また、IRSp53が細胞外小胞産生していることを生体内でも証明する為、既に作成済みのIRSp53 WTもしくはKO細胞を免疫ノックアウトマウスの皮下に移植し、移植した細胞からIRSp53依存的に細胞外小胞が放出されていないか検証を行う予定である。
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