2019 Fiscal Year Research-status Report
出芽酵母におけるM期離脱シグナル伝達経路の非対称性の分子機構の解明
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19K06641
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
前川 裕美 九州大学, 農学研究院, 講師 (80399683)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | SPB / Ogataea polymorph / 細胞周期 / メタノール資化酵母 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母モデルSaccharomyces cerevisiaeにおいてMENシグナル伝達経路はSpindle Pole Body (SPB)に局在し、細胞周期制御に必須の役割を果たす。MEN経路が子嚢菌酵母において広く保存されているかを検証するために、S. cerevisiaeとは進化的に離れたメタノール資化酵母Ogataea polymorphaを対象にMEN構成因子の同定と機能解析を行なった。ホモロジー検索によりS. cereivisaeのMENの主要構成因子の相同因子を見いだし、GFP融合遺伝子がSPBに局在することを示した。Cdc15キナーゼについてはゲノム配列からは相同遺伝子を見出せなかったが、Ste20キナーゼファミリーに属する遺伝子の中からSPB局在がみられるHcd1遺伝子を見出した。OpHCD1遺伝子破壊株は生育不能であったため、ATPアナログ感受性変異（as変異）導入することにより条件変異株を得ることができた。hcd1-as変異株は1NM-PP1存在下で分裂後期遅延の表現型を示したことから、OpHcd1はMEN因子であることが示唆された。OpHcd1の細胞内局在を解析したところ、ScCdc15とは異なりOpHcd1は分裂後期の母細胞中のSPBにのみ局在することが分かった。
O. polymorphaでは、遺伝子破壊などのゲノム操作ツールが十分に整備されていないため、条件変異株の作製が困難である。そこで、Tet-OFFシステムの構築を試みた。既存のTetシステムはO. polymorpha中では十分に働かなかったが、O. polymorpha由来のtata配列とTetR’-OpSSN6融合遺伝子を導入することにより、発現抑制レベルに課題は残るものの、O. polymorphaにおける遺伝子発現ON/OFF制御システムを構築することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
O. polymorphaのMEN構成因子のホモログの細胞内局在の解析から、O. polymorphaのMEN因子がS. cerevisiaeと一部異なる局在制御を受けることを見いだした。２つの酵母種のMENについて、特にScCdc15とOpHcd1、OpHcd2に焦点を当てて分子基盤の相違点と共通点を解明するという方針を定めることができた。また、ゲノム遺伝子操作ツールの構築を進めることができたことも今後の研究に役に立つ。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度の研究成果から、２つの酵母種ではG蛋白質（Tem1）の下流因子であるMENキナーゼのSPB局在制御に大きな違いがあることが明らかになった。
この局在制御の分子基盤の相違点と共通点を明らかにすることが、MEN非対称性を理解する鍵であると考えており、今後はO. polymorphaのHcd1およびHcd2のSPB局在の分子基盤の解明に注力する方針である。
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| Causes of Carryover |
当初予定よりも多くの遺伝子・菌株を扱うために薬品・分子生物学試薬の支出が必要となった。そこで、予定していたフロア型冷却付遠心機の購入を取りやめて、同じ実験室の研究者所有の遠心機で代替し、試薬代の不足分に充てた。次年度は当初予定額の使用計画に加えて、顕微鏡観察を集中的に計画しており、次年度使用額は旅費および施設使用料に充てる計画である。
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