細胞膜湾曲作用をもつ分子FCHO2によるエンドサイトーシスの制御機構

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06643
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 中西 宏之 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (80314318)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: FCHO2 / BARドメイン / Nedd4ファミリー / 細胞膜 / 曲率 / クラスリン / エンドサイトーシス / ユビキチン化

Outline of Annual Research Achievements

BAR/F-BARドメインはバナナのような立体構造をもつ細胞膜結合ドメインであり、その分子に固有の曲率で細胞膜を湾曲させる。本研究では、F-BARドメインをもつタンパク質FCHO2に焦点を絞り、そのF-BARドメインが形成する固有の曲率の役割を明らかにすることを目的としている。
FHO2が形成する細胞膜の曲率を認識する分子が存在すると仮定し、その分子候補としてユビキチン化酵素Nedd4ファミリーについて解析を行った。その結果、Nedd4ファミリーに属するNedd4L がそのC2ドメインを介してカルシウム依存性およびホスファチジルセリン依存性に膜に結合することを見出した。さらに、Nedd4Lは直径50nmのリポソーム（FCHO2が形成する曲率とおなじ）と選択的に結合して活性化された。また、細胞レベルでFCHO2のF-BARドメインが形成する形質膜の陥入にNedd4LがC2ドメインを介して特異的にリクルートされ、活性化されることを明らかにした。FBP17が形成する膜陥入（FCHO2より大きな曲率）やamphiphysinが形成する膜陥入（FCHO2より小さい曲率）にはリクルートもされず、活性化もされなかった。Nedd4Lの活性化は自己ユビキチン化を指標として測定した。加えて、培養上皮細胞内にFCHO2、Nedd4L、クラスリンの蛍光タンパク質を共発現させると、３者は共局在することを見出した。
以上のことから、Nedd4LのC2ドメインはFCHO2 F-BARドメインが形成する膜湾曲率を認識して結合する。さらに、結合することによってNedd4Lは活性化されると考えられる。また、Nedd4Lはクラスリン被覆ピットにFCHO2と共局在することから、被覆ピットでFCHO2が膜曲率を介してNedd4Lをリクルートし、活性化していると示唆される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

試験管内でNedd4Lが直径50 nmのリポソーム（FCHO2が形成する細胞膜曲率と同じ）に特異的に結合して活性化されるデータを得ることができた。一方、FCHO2が形成する屈曲した細胞膜にNedd4Lが結合して活性化されるか（自己ユビキチン化で測定）を検証した結果、FCHO2とNedd4Lによる細胞膜への結合が競合的であり、FCHO2によるNedd4Lの活性化のデータは得られなかった。
クラスリン依存性エンドサイトーシスの過程を細胞レベルで解析するために、上皮性ナトリウムチャンネル（ENaC）を発現させた培養細胞の細胞株を作製している。ENaCはα、β、γの３つのサブユニットから構成され、Nedd4Lによるユビキチン化によってクラスリン依存性にエンドサイトーシスされる。β、γのサブユニットの遺伝子をそれぞれ個別の薬剤耐性選択のベクターに組み込み、HeLa細胞にトランスフェクションして薬剤選択を行って、βとγの両サブユニットの安定発現細胞株を樹立した。さらに、この細胞株を用いて、テトラサイクリン発現誘導システムを利用したαサブユニット遺伝子をトランスフェクションし、α、β、γサブユニットの発現細胞株を樹立した。
Nedd4ファミリー以外に直径50nmの曲率の膜を特異的に認識する分子の網羅的検索をおこなうために、直径400nm、200nm、100nm、50nm、25nmのリポソームをフィルターを用いて作製し、電子顕微鏡でその直径を確認した。FCHO2とタンパク質―タンパク質相互作用する新しい分子を検索するために、プルダウン法に用いるFCHO2の様々なコンストラクトを作製し、さらに免疫沈降法に用いるFCHO2の抗体も作製した。

Strategy for Future Research Activity

今後の方策として、分子レベルと細胞レベルでFCHO2による細胞膜屈曲率を介したNedd4Lの活性化を示すデータを得る。上述したように、試験管内で細胞膜、FCHO2、Nedd4Lを混合し、Nedd4Lの自己ユビキチン化でアッセイした場合には、Nedd4Lの活性化は見られない。そこで、膜に細胞膜貫通タンパク質ENaCを導入して基質として用いた新しいアッセイ法を確立し、このアッセイ系でFCHO2によるNedd4Lの活性化を検証する。ENaCの各サブユニットは細胞内ドメインにPYモチーフをもち、Nedd4Lのwwドメインとタンパク質―タンパク質相互作用を介して結合することが知られている。したがって、細胞膜にENaCを導入すると、FCHO2とNedd4Lの細胞膜への結合がそれぞれタンパク質―脂質相互作用とタンパク質―タンパク質相互作用となり、競合的でなくなると考えられる。FCHO2による細胞膜屈曲率を介したNedd4Lの活性化のデータが得られると期待される。
樹立したENaC発現細胞株にFCHO2、Nedd4L、クラスリンを共発現させて、それぞれの分子がエンドサイトーシスのどのステップでどのような関係になるのかをタイムラプス全反射顕微鏡を用いて観察する。また、FCHO2やNedd4Lをノックダウンし、他の分子の局在やクラスリン依存性エンドサイトーシスへの影響を調べる。
FCHO2とタンパク質―タンパク質相互作用する分子をyeast two hybrid法、プルダウン法、免疫沈降法を駆使して検索する。FCHO2と膜曲率を介して結合する分子候補を検索するために、直径400nm、200nm、100nm、50nm、25nmのリポソームとラット脳可溶画分とインキュベーションする。Nedd4ファミリー以外の分子を同定し、分子レベル、細胞レベルで解析する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの影響で、購入を予定していた物品が年度内に入荷する可能性がなくなり、残額が生じた。翌年度に改めて購入予定である。