細胞膜湾曲作用をもつ分子FCHO2によるエンドサイトーシスの制御機構

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06643
• Research Institution: Kumamoto University
• Principal Investigator: 中西 宏之 熊本大学, 大学院生命科学研究部(医), 教授 (80314318)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: FCHO2 / BARドメイン / Nedd４ファミリー / 細胞膜湾曲 / クラスリン / エンドサイトーシス / ユビキチン

Outline of Annual Research Achievements

BARドメインは細胞膜結合ドメインであり、その分子に固有の曲率で細胞膜を湾曲させる。FCHO2はBARドメインをもつタンパク質であり、クラスリン被覆ピットの形成に重要な役割を担っている。本研究では、BARドメインをもつタンパク質FCHO2に焦点を絞り、そのBARドメインが形成する固有の曲率の役割を明らかにすることを目的としている。本研究ではFCHO2の細胞膜の曲率を認識する分子が存在すると推測し、その分子候補としてのユビキチン化酵素Nedd4Lを解析していた。Nedd4Lは上皮性ナトリウムチャネル（ENaC）等の膜タンパク質をユビキチン化して、クラスリン依存性エンドサイトーシスを制御している。
その結果、Nedd4Lの自己ユビキチン化を指標としてインビトロで酵素活性を測定すると、Nedd4Lは直径50nmのリポソーム（FCHO2が形成する曲率と同じ）と選択的に結合して活性化された。ENaCのペプチドを基質として酵素活性を測定すると、Nedd4Lが基質と結合すること、基質は細胞膜と結合していることがNedd4Lの活性化に必要であった。また、細胞レベルでFCHO2のBARドメインが形成する膜湾曲にNedd4LがC2ドメインを介して特異的にリクルートされ、活性化されることを明らかにした。他のBARタンパク質のFBP17やamphiphysinの膜湾曲にリクルートされず、活性化もされなかった。加えて、培養上皮細胞にFCHO2、Nedd4L、クラスリンの蛍光タンパク質を共発現させると、３者は共局在することを見出した。
以上のことから、クラスリン被覆ピットにおいてNeddd4LはC２ドメインを介してFCHO2のBARドメインが形成する膜湾曲に結合して活性化されることが明らかになった。さらに、ENaCのような膜タンパク質と結合することがNedd4Lの活性化に必要であることが判明した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

上皮性ナトリウムチャネル(ENaC)はNedd4Lによるユビキチン化によってクラスリン依存性のエンドサイトーシスされることが知られている。細胞レベルでのエンドサイトーシスを解析するために。ENaCのα、β、γの３つのサブユニットを発現させた培養上皮細胞の細胞株を作製している。この細胞株においてNedd4LをノックダウンするとENaCのユビキチン化が阻害され、エンドサイトーシスが阻害された。同様に、FCHO2をノックダウンによってENaCのユビキチン化が阻害され、エンドサイトーシスが阻害された。したがって、FCHO2がNedd4LによるENaCのユビキチン化を制御し、そのクラスリン依存性エンドサイトーシスをコントロールしていることが明らかになった。
また、ENaC発現培養上皮細胞の細胞株を用いて、ENaCはクラスリン被覆ピットでFCHO2と共局在することを明らかにした。一方、Nedd4Lを強制発現させると、ENaCのエンドサイトーシスが亢進し、細胞膜上にあるENaCとNedd4Lの共局在のデータを得ることができなかった。しかしながら、野生型の培養上皮細胞にNedd4L、クラスリンの蛍光タンパク質を共発現させると、両者は内在性のFCHO2と共局在することを見出した。

Strategy for Future Research Activity

今後の方策として以下の３点を推進する予定である。
１）Nedd4Lの活性メカニズムを解析する。Nedd4LのC２ドメインはHECTドメインと結合して、活性を自己阻害している。C2ドメインが細胞膜と結合すると自己阻害が解除され活性化されると推測される。C2ドメインのみのタンパク質とHECTドメインのみのタンパク質が結合するか、その結合が細胞膜や細胞膜湾曲によって競合的に阻害されるかを調べる。
２）クラスリン被覆ピットにクラスリン、FCHO2、Nedd4Lがリクルートされる過程を、タイムラプス顕微鏡を使用して観察する。
３）FCHO2とタンパク-タンパク相互作用する分子をyeast two hybrid法、プルダウン法、免疫沈降法を駆使して検索する。FCHO2と膜曲率を介して結合する分子候補を検索するために、直径400nm、200nm、100nm、50nm、25nmのリポソームとラット脳可溶画分とインキュベートする。Nedd4ファミリー以外の分子を同定し、分子レベル、細胞レベルで解析する。

Causes of Carryover

新型コロナウイルスの影響で、購入予定していた物品の入荷が遅れるとともに、論文のリバイス実験が遅れて残額が生じた。翌年度に改めて購入し、早急に計画を遂行する予定である。