2019 Fiscal Year Research-status Report
Identification of regulatory factors for the mammalian Golgi stress response by GeCKO screen
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19K06645
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| Research Institution | University of Hyogo |
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Principal Investigator |
吉田 秀郎 兵庫県立大学, 生命理学研究科, 教授 (60378528)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゴルジ体 / ストレス / プロテオグリカン / ムチン / コレステロール / 神経変性疾患 / TFE3 / KLF |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内には小胞体やゴルジ体など様々な細胞小器官が存在し、細胞の機能を分担している。細胞小器官の存在量は細胞の需要に応じて厳密に制御されており、必要な時には必要な細胞小器官だけが必要な量だけ増やされる。このような細胞小器官の量的調節機構は細胞が自律的に機能するために必須の機構であり、細胞生物学の根本的命題である。研究代表者は森和俊博士の下で小胞体ストレス応答の基本機構を明らかにした後、ゴルジ体の量的調節機構であるゴルジ体ストレス応答を世界に先駆けて開始し、これまでにTFE3経路とプロテオグリカン経路、ムチン経路、コレステロール経路の４経路を発見した。本研究課題では、これらゴルジ体ストレス応答の４経路の分子機構を明らかにするために、これらの経路の制御因子を様々な方法によって同定することを目指している。CRISPR-cas9の系を用いたゲノム・ワイド・スクリーニング（GeCKOスクリーニング）やsiRNAスクリーニング、in silicoでの検索、酵母one hybrid screening、promoter解析など多岐にわたる方法によって制御因子を検索したところ、プロテオグリカン経路の転写因子KLFやムチン経路のエンハンサー配列MGSE、コレステロール経路の制御因子OSBP1とPITPNBを同定した。TFE3経路に関しては、スクリーニングのための細胞を樹立中である。今後更に他の制御因子を同定していくことによって、ゴルジ体ストレス応答の分子機構を明らかにしていく。また、同定した制御因子のノックアウトマウスを作製してその表現型を解析することによって、ゴルジ体ストレス応答の生理学的重要性を明らかにし、個体におけるゴルジ体ストレス応答の全貌を明らかにしようと考えている。その成果は、ゴルジ体ストレス応答が関与する様々な疾患（神経変性疾患など）の予防・診断・治療に役立つものと期待している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度の解析によって、プロテオグリカン経路を制御する転写因子KLFを同定した。KLFを細胞で過剰発現するとプロテオグリカン経路が活性化され、特異的なエンハンサー配列PGSEからの転写が誘導される。KLFのdominant negative体を過剰発現すると内在性のKLFの機能が阻害され、プロテオグリカン経路の活性化が阻害されることを見出した。興味深いことに、プロテオグリカン経路を活性化させるとKLFの発現が著しく増加することもわかった。今後は、KLFの発現・活性制御機構を解析し、プロテオグリカン経路のセンサー分子を同定する計画である。ムチン経路に関しては、特異的なエンハンサー配列MGSEを同定することができた。今後はMGSEに結合する転写因子を検索するとともに、CRISPR-cas9の系を用いたゲノム・ワイド・スクリーニング（GeCKOスクリーニング）によってムチン経路のセンサー分子を同定する。コレステロール経路に関してGeCKOスクリーニングを行ったところ、コレステロール輸送に関与する因子OSBP2やPITPNBを同定した。TFE3経路に関しては、siRNAスクリーニングによるセンサー分子の同定を試みた。スクリーニングに用いる細胞（TFE3-GFPを発現するレポーター細胞）を樹立しようとしたが、TFE3の細胞毒性のためか、樹立は困難を極めた。そこで、ゲノムに組み込むことなく自律的に複製できるプラスミド（pEB-Multi)を用いたり、transposaseを用いてゲノムに高効率で組み込むことによって、TFE3-GFP細胞を樹立できる一歩手前まで進むことができた。TFE3の細胞毒性の問題を回避するために、TFE3のNLSとNESを同定したので、レポーター細胞にはこれらの部分のみを組み込む計画である。以上のことから、本研究課題は「おおむね順調に進展している」と判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
プロテオグリカン経路に関しては、GeCKOスクリーニングによってセンサー分子を同定する計画である。スクリーニングはレポーターとして毒素遺伝子DT-Aを用いた方法を計画している。特異的なエンハンサー配列PGSEにDT-APをつなぎ、細胞に導入する。プロテオオグリカン経路を活性化するとこの細胞は死滅する。この細胞の遺伝子をCRISPR法によって一つ一つ破壊した変異体細胞を作製し、プロテオグリカン経路を活性化してもDT-Aレポーターの発現が誘導されず死滅しない変異体を検索する。但し、この方法はDT-Aの発現レベルを普段は死なず、活性化したときのみ死ぬように調節する必要がある。うまく行かない場合は、特異的なエンハンサー配列PGSEにGFPをつなぎ、プロテオオグリカン経路が活性化されなくなる変異体をFACSを用いて検索する。研究科に高性能の新型FACSが導入されたので、それを使用する予定である。また、同定した転写因子KLFについて抗体を作製し、その発現・活性調節機構を解析する。更に、KLFのノックアウトマウスを作製しその表現型を解析する。ムチン経路に関しては、特異的なエンハンサーMGSEに結合する転写因子を酵母one hybrid screeningによって検索する計画である。GeCKO screeningも併行して行い、転写因子に加えてセンサー分子も検索する。コレステロール経路に関しては、コレステロール経路を制御する特異的なエンハンサー配列をOSBP2のpromoter解析によって同定する。エンハンサー配列を同定後、酵母one hybrid screeningやin sillico screeningによって転写因子を検索する予定である。TFE3経路に関しては、センサー分子を同定する計画である。既に進んでいる siRNAスクリーニングに加えて、GeCKO screeningも行う。
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| Remarks |
研究代表者の研究室のホームページ
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Research Products
(17 results)
