2019 Fiscal Year Research-status Report
メカノセンシングに必要なRho-GEF、Soloによる特異なアクチン骨格制御機構
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19K06652
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
山下 和成 東北大学, 生命科学研究科, 助教 (70589481)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Solo / RhoA-GEF / メカノセンシング |
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| Outline of Annual Research Achievements |
アクトミオシンが作る骨格であるストレスファイバーは、その収縮力によって細胞の形態変形に働くと共に、細胞外基質の硬さを認識して増殖・分化を制御する、メカノセンシングの中核を担う構造であるが、その形成過程や機能発揮にはいまだに謎が多い。アクトミオシンの形成・収縮には、「RhoA-GEFによるRhoAの活性化」が必要である。ストレスファイバーの両端は接着斑によって細胞外基質に繋ぎとめられており、接着斑にはGEF-H1などのRhoA-GEFが局在することがわかっている。しかし、ストレスファイバー中腹部の収縮機構はいまだ不明である。Soloは、当研究室で同定したRhoAのGEFであり、細胞膜上に顆粒状の局在を示す。この、Soloが集積している領域では、ストレスファイバーが過剰に発達していることがわかった。顆粒のサイズを考慮すると、Soloは細胞膜上にある何かしらのマイクロドメインのような構造に集積していることが示唆される。この構造が何で構成されているのかを明らかにすることが本研究の主たる目的である。
現在、精製タグ（SBP）を融合したSoloを培養細胞に安定発現させて、これを精製し、質量分析を行うことでSolo結合タンパクの同定を試みている。また、非特異的ビオチン化酵素BirAをSoloと融合して細胞に発現させ、Soloの近傍約20nmの範囲にある分子をビオチン化によってラベルし、これら分子をストレプトアビジンビーズで精製するBioIDという方法を用いてSolo集積マイクロドメインの構成因子を同定することも試みている。両プロジェクトとも、タグと融合したSoloを安定発現する培養細胞の作成が完了した。現在は標的タンパク質の同定を試みている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
実験手法として、精製タグ（SBP）を融合したSoloを培養細胞に安定発現させて、これを精製し、質量分析を行うことでSolo結合タンパクの同定を試みている。また、非特異的ビオチン化酵素BirAをSoloと融合して細胞に発現させ、Soloの近傍約20nmの範囲にある分子をビオチン化によってラベルし、これら分子をストレプトアビジンビーズで精製するBioIDという方法を用いてSolo集積マイクロドメインの構成因子を同定することも試みている。
現時点では、両プロジェクトとも、タグと融合したSoloを安定発現する培養細胞の作成が完了したが、質量分析による標的タンパク質の同定が完了していないため、計画よりもやや遅れていると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
上述の、ビオチン化酵素BirAを融合させたSoloを用いたBioID法を行い、ビオチンラベルされたタンパク質を精製して質量分析を行う予定である。この、「Soloの近傍に存在するタンパク質」は、おそらく複数同定されると思われる。これらタンパク質の発現ベクターを作成し、細胞に発現させて、「Soloが集積するマイクロドメイン」に実際に局在するタンパク質を同定していく予定である。
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| Causes of Carryover |
現在、標的タンパク質同定のための培養細胞の作成までは完了しているが、これらタンパク質を精製するための大量培養や大量精製は計画の遅れにより実行できなかったため、今年度の使用額が低くなった。これら実験計画は、これから行っていく予定である。
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