2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K06668
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Research Institution | National Institute for Basic Biology |
Principal Investigator |
鎌田 芳彰 基礎生物学研究所, 多様性生物学研究室, 助教 (20291891)
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Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
松浦 彰 千葉大学, 大学院理学研究院, 教授 (10272692)
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Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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Keywords | 細胞応答 / アミノ酸 / トア複合体 / 酵母 |
Outline of Annual Research Achievements |
本研究において、私はアミノ酸センシングの中枢である、トア複合体1(TORC1)がアミノ酸情報を感知し活性制御を受ける分子メカニズム の解明を目標に研究を行っている。特に、本研究の最大の目的は、現在提唱しているTor1のFRBドメイン-tRNA結合を介した新規TORC1制御モデルの検証である。 今年度は、(1)昨年度に引き続き、微生物化学研究所・野田展生博士との共同研究を行い、 tRNA-FRBの結晶構造解析を試みたが、残念ながら失敗した。。iTC200による分子間相互作用も試みたが、こちらも失敗した。おそらく、FRBドメインとtRNAとの結合が大変弱いためと考えられる。 (2)昨年度、tRNA-FRB結合のNMR解析によって、tRNAとの結合に必要なFRB内アミノ酸残基が判明した。今年度は、in vitro mutagenesis法を用いて、tRNAとの結合能を失ったTor1のFRB変異体を数種類、これらの変異体の表現型を観察するための酵母株を作製した。 (3)更にTORC1によるタンパク質翻訳開始の制御について解析を行なった。翻訳開始因子eIF4E(4E)はmRNAのcap構造に結合し、eIF4G(4G)と複合体を形成し、リボソームをリクルートする。4E結合タンパク質(4EBP)は4Eに結合し、4E-4G結合を競合阻害する。哺乳類では4EBPはmTORC1によりリン酸化を受け、4E結合が制御されると報告がある。本研究では、酵母の4EBPホモログCaf20の解析を行なった。今年度に得られた結果は、①Caf20はTORC1依存的にリン酸化される。②Caf20は4Eとは結合するが、4Gとは結合しない。③しかし、4E-Caf20結合は、TORC1活性/Caf20リン酸化に非依存的に見られる。④以上の結果から、Caf20は哺乳類4EBPとは違う機能を持っていることが示唆された。
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Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
微生物化学研究所・野田展生博士との共同研究である、結晶構造解析が失敗したことが大きい。また、コロナ禍において、双方の研究はもとより、情報交換なども頻繁に行えなかったこと、試薬の入荷などが遅れたことも原因として挙げられる。 また、Tor1のFRB変異体のクローニングや、解析に用いる酵母株の作成にも予想外の時間がかかった。前者においては、gap-repairPCRを用いたsite-directed mutagenesis法を知るまで時間が掛かり、後者は3種の必須遺伝子の破壊株の作成効率が予想外に悪く、時間をかけてしまった。これらの要因のひとつは、老朽化したPCRサーマルサイクラーであり、今年度新規に購入以来、順調に進むようになった。
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Strategy for Future Research Activity |
(1)野田博士との考察の末、FRBドメイン単独での解析を諦め、トア複合体全体を精製し、クライオ電顕による構造解析を行うことを決定した。今後は、まずクライオ電顕に供するためにTORC1の精製を行う。精製効率を上げるために、それぞれのコンポーネントタンパク質を強発現するためのプラスミドを作製することから始める。コンポーネントのひとつ、Kog1にTAPタグを付けるので、発現さえうまくいけば、大量精製は可能であろうと予想される。 (2)変異体解析では、変異体、酵母株が準備できたので、今後その解析を行う予定である。栄養飢餓条件での生存率、細胞周期、TORC1基質Atg13のリン酸化(in vivo TORC1活性)、in vitro TORC1活性の測定を行う。 (3)4E-Caf20複合体が常に見られることから、これがどのような機能を持っているのか、解析したい。Polysomeに含まれ、直接翻訳に関与しているのか、いないのか、ポリソーム解析を行い、どの画分にCaf20が含まれるのか、解析したい。更に4E-Caf20がmRNAと結合しているなら、RNAシークエンスを行い、特定の遺伝子の翻訳に関わっているのか、決定したい。
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