2020 Fiscal Year Research-status Report
腎尿細管の再生を可能とさせる非コードDNAランドスケープの全容解明
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19K06672
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
越智 陽城 山形大学, 医学部, 准教授 (00505787)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 再生エンハンサー / 転写因子 / ゲノム / 腎再生 / 網羅的オープンクロマチン解析 / クロマチン免疫沈降シーケンス / シングルセルRNA-seq発現解析 / ツメガエル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、腎尿細管の再生に関わる遺伝子群の非コードDNA領域の機能を俯瞰的な視点から捉え、個体内でのネフロン再生を可能とさせるシス調節メカニズムの全容解明を目指すものである。この目的で、腎尿細管の再生過程をライブイメージングできるトランスジェニック・ツメガエルから摘出した再生中の腎管細胞の網羅的オープンクロマチン領域解析と、再生組織でのin vivoエンハンサー同定法による個体内機能解析から、実際の再生中の腎管で使われる全エンハンサーの同定を行うことにした。具体的には、(1) 腎尿細管の再生中の細胞における網羅的オープンクロマチン領域解析、(2) 再生中の腎尿細管で活性をもつエンハンサーの網羅的探索、(3) オープンクロマチン領域で実際にエンハンサー活性を持つ領域で共通してみられる転写因子結合モチーフから新規の再生エンハンサーの活性化メカニズムの解明を計画している。本年度は、H3K27 のアセチル化修飾（H3K27ac）抗体を用いた免疫沈降シーケンスを行い、昨年度行った網羅的オープンクロマチン領域解析の結果をあわせた再生エンハンサーの候補の絞り込みと、トランスジェニックレポーター解析による再生時のエンハンサー活性の検討、それら候補領域を活性化する転写因子の探索を行った。また、新学術領域「学術研究支援基盤形成」先進ゲノム支援」の協力の下に、損傷前、再生2日目、再生5日目のシングルセルRNA-seq発現解析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
損傷前、再生2日目、再生5日目の網羅的オープンクロマチン領域解析とH3K27acの免疫沈降シーケンスの結果について、ゲノムのいずれの領域にエンリッチしているのか調べたところ、網羅的オープンクロマチン領域については、損傷前、再生2日目、再生5日目のいずれも転写開始点近傍と進化的に保存された非コードDNA領域(conserved non-coding DNA sequence: CNS)にエンリッチしていることがわかった。一方、H3K27acについては、転写開始点近傍のピークは損傷前、再生2日目、再生5日目のいずれにおいても認められたのに対して、CNSについては再生2日目と再生5日目でのみピークが認められた。オープンクロマチン領域のなかでもH3K27acのピークが見られる領域について、個体内での再生エンハンサー活性の有無を検討したところ、再生中の腎尿細管でエンハンサー活性を持つことがわかった。また、再生2日目のオープンクロマチン領域にエンリッチしている転写因子の結合モチーフについて、ヒートショック依存的にそれら転写因子を再生時に発現させるトランスジェニックツメガエルを作製し機能を調べたところ、一部の転写因子について腎尿細管を誘導する活性があることがわかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度に引き続きオープンクロマチン領域のなかでもH3K27acのピークが見られる領域についてツメガエルのトランスジェニックシステムを用いて、再生中の腎尿細管で活性をもつエンハンサーの網羅的な探索を行うとともに、ヒートショック依存的に転写因子を再生時に発現させるトランスジェニックツメガエルを作製し、再生エンハンサーの活性化因子の同定を進める。また、損傷前、再生2日目、再生5日目のシングルセルRNA-seq発現解析の結果についてもデータ解析を進め、個体内でのネフロン再生を可能とさせるシス調節メカニズムの全容解明を行う予定である。
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