2020 Fiscal Year Research-status Report

哺乳類卵子活性化に伴う表在タンパク質動態のプロテオミクス解析

Research Project

Project/Area Number	19K06686
Research Institution	Gunma University
Principal Investigator	佐藤裕公群馬大学, 生体調節研究所, 准教授 (40545571)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	卵子活性化 / プロテオミクス / 初期発生 / イメージング
Outline of Annual Research Achievements	現在、我が国を含む先進諸国では16%以上の夫婦が不妊に悩み、少子化による影響は人口減少だけでなく患者らの生活の質の低下など様々な面で社会問題化している。近年、特にその原因は出産年齢の高齢化による卵子発生能の低下、すなわち卵子の質の低下が原因とされることが多く、より産仔に結び付く卵子や胚を見出す判定法の開発とともに、質の低下を抑制するための原因メカニズムの解明が求められている。現在までの卵の質研究においては、染色体の構造や安定性、細胞質因子の分布といった、細胞内の因子の解析に基づくものが多い。このため、これらを評価するには卵内にそれら因子のインジケーターを注入する、あるいは割球採取するなど侵襲的な手法をとることが多かった。そこで本研究では、ヒト卵子に似た特徴を示すマウス卵子を用い、未受精卵や受精後の卵（胚）の表面に存在するタンパク質に注目し、プロテオミクス解析によって卵子や胚の質を見分けるための表面分子を探索する。また、それら候補分子の動態について申請者は得意とする超低侵襲性イメージング法により、目的因子（遺伝子）の機能解析を行うとともに、その動態をなす基盤分子メカニズムを解明することを目的としている。当該年度は、ここまで確立した効率的な卵子プロテオミクス解析技術を応用し、野生型マウス及び卵子の性質に変調をきたす遺伝子変異マウスの卵子などについてプロテオミクス解析用試料を収集し、比較プロテオミクスに成功した。また、予備実験とここまでの解析から注目する卵の表面分子をいくつか検討し、受精前後と初期発生における低侵襲性の動態解析に成功した。また、これら注目すべきタンパク質たちが、特定の翻訳語修飾を介して異なる初期発生のステージで分解に向かう分子機構について明らかにした（論文校正中）。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason マウス卵子、特に本研究でも用いている遺伝子組換えマウスに由来する卵子は、性ホルモン等による過剰排卵条件下においても~30個／成熟個体程度の細胞数しか得ることができないため、プロテオミクスの解析のように物量と成果が比例する解析においては解析条件の検討が非常に難しい。また、本研究のように比較プロテオミクス解析を行う場合には、定量性を担保するために1条件辺り３バッチ以上の解析対象を確保するなど、通常の解析よりも物量が必要になるため、慎重な条件検討が必要となる。これに対し、申請者らは、ここまでの検討をもとに、非酵素的に解析を阻害するタンパク質を除去するアプローチと新たな可溶化条件の検討、およびTandem Mass Tag（TMT）システムにおける比較プロテオミクスの解析感度から最も検出感度の高い比較条件を見出すことに成功し、これをもとに遺伝的・条件的に異なる卵子について包括的な比較解析結果を得ることに成功した。この結果、これまでに予想していなかった様々な因子について今後の解析候補を挙げることができた。また、プロテオミクス解析の予備実験の結果から解析をはじめ、並行して進めていたいくつかの代表的な胚表面分子に関する動態・機能解析について、蛍光タンパク質タグの導入による動態と分解機構に関する解析などが進んだ結果、少なくともここまで調べた胚表面因子は、母性因子として認識され、特定の翻訳語修飾を介して積極的に初期胚にて分解されることを明らかにした．多くの表面因子についてクローニングを進めるなかで、より多くの蛍光波長を用いて同様の動態解析を始める基盤ができたため、プロテオミクス解析と合流して解析の基盤を広げる予定である。
Strategy for Future Research Activity	今後は、本研究のコアデータとなる包括的比較プロテオミクスの結果をもとに、注目する因子（遺伝子）を再度選定する。その後、それら因子の遺伝子に欠損や変異を持つマウスを作製・収集することにより、卵子の形成・老化・初期発生にとってそれらがどのくらい重要なものなのか解析する。また、それら因子についてクローニングとともに蛍光タンパク質による動態解析基盤を整える。動態解析はまずは野生型マウス由来の卵子を用いてmRNAの注入によって動態解析をすすめ、必要に応じて多波長を用いて同時に様々な膜動態マーカーとの共局在なども解析する。さらに、遺伝子組換えマウスが期間内に入手できれば、そのマウス由来の卵子に必要に応じて目的因子の変異体を強制発現させることで、機能補完実験を試みる。とくに、ここまでの研究で示唆されている翻訳語修飾と目的タンパク質との関連性や、分解の有無・タイミングについて注目し、共通する概念があればそこに注目して進め、その詳細な機能を明らかにする。また、特に受精や初期発生に重要と思われるもの、あるいは比較プロテオミクスにおいて群間で差が大きかったものについては、抗体を用いた免疫染色やウェスタンブロッティングなど、内因性因子に関する詳細な解析も進める。同時に、ヒトにおける疾患との関連については、老化や不妊症（遺伝性不妊）に対する遺伝子変異のデータベースとの照合を進めたい。また、CD9の研究で見られたように立体構造解析などから思わぬ有用な知見を得られる可能性があるので、積極的に検討し標的分子に関する包括的な理解を目指す。