マウス個体発生におけるTead/Yap依存的細胞競合に関する研究

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06687
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 橋本 昌和 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (60580496)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 細胞競合 / エピブラスト / 多能性

Outline of Annual Research Achievements

多細胞生物の発生では、ゆらぎにより個々の細胞の分化状態などに一時的にばらつきが生じる。正確な発生を遂行するためには不適合な細胞を排除することが必要であり、その様な排除を行う仕組みの一つに細胞競合がある。しかし細胞競合研究の多くはハエの組織や培養細胞に人為的に導入した前がん状態の異常細胞の排除の研究であり、哺乳類の正常発生で生じる細胞状態のばらつきに関する研究は少ない。特に隣接細胞の状態を認識するメカニズムについては全くわかっていない。
本研究では申請者が見出した、着床前マウス胚の多能性細胞(エピブラスト)の形成時に起こる細胞競合による品質管理機構に着目し、不適合な細胞を認識するしくみを解明することを目的とし、特殊なプロテアーゼを用い、胚盤胞全体からエピブラストと原始内胚葉を含む内部細胞塊のみを単離し単一細胞まで分離する手法を確立し、シングルセルRNAシーケンスを行った。コントロール条件で培養した胚では既知のマーカーの発現量からエピブラストと原始内胚葉の細胞を完全に分離させることができた。細胞死を抑制した胚では、正常なエピブラストと原始内胚葉の他に通常条件下では排除されるべき多能性の低い細胞の特徴を持った細胞を検出することができた。現在までに多能性の低い排除されるべき細胞において特異的に発現する遺伝子をin silicoスクリーニングをおこない、それらの因子のノックアウトマウスや強制発現トランスジェニックマウスなどを作成し、機能を評価する系を構築した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

後期胚盤胞をシングルセルにすることが困難であったが、その問題解決に成功し、無事scRNA-seqを行いデータ解析まで漕ぎ着けることができた。解析データから、既知のマーカーの発現量からエピブラストと原始内胚葉の細胞を完全に分離させることに成功している。また、ノックアウトマウスの作成やコンディショナル強制発現マウスに関しても安定して作出できている。さらにはES細胞を用いたin vitroで細胞競合を再現する系も確立でき、競合に関する因子のゲノムワイドなスクリーニングにまでは至っていないが全体としておおむね順調に進展しているといえる。

Strategy for Future Research Activity

多能性の低い排除されるべき細胞において特異的に発現する遺伝子についてノックアウトマウスの作成や強制発現系の実験により、多能性の違いを認識する機構に関わる遺伝子の同定を目指す。また、ES細胞の競合系を用いてsiRNAライブラリなどによって競合に関する因子のゲノムワイドなスクリーニングを目指す。

Causes of Carryover

コロナ禍において現地開催がなかったあるいは延期された学会に参加するために当初使用予定だった旅費が未使用となった。また、ES細胞を用いたin vitro細胞競合系の実験系の構築に時間がかかり、その系を用いたスクリーニングを行えなかったことが挙げられる。次年度には本来予定していたES細胞を用いたスクリーニングを行うため、それにかかるRNAシーケンスの外注代や延期された学会への参加旅費などに使用する予定である。