2020 Fiscal Year Research-status Report
造血幹細胞ニッチの遺伝子発現ネットワークの構築および維持機構の解明
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19K06688
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
尾松 芳樹 大阪大学, 生命機能研究科, 准教授 (80437277)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 骨髄 / 造血幹細胞 / ニッチ / 間葉系細胞 / 発生 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
血管を循環するほとんど全ての血液細胞・免疫細胞を産生する造血幹細胞および前駆細胞は骨髄に存在するニッチと呼ばれる特殊な微小環境によって維持され、精緻に制御されている。申請者らのこれまでの研究により、ケモカインCXCL12を高発現する細網細胞（CAR細胞）が、造血幹細胞・前駆細胞ニッチの中心的な構成細胞であることが示された。さらにCAR細胞の形成と維持に必須の転写因子Foxc1およびEbf3/1が同定され、それぞれCAR細胞の脂肪細胞と骨芽細胞への分化を抑制しニッチとしての特性を維持していることが明らかになった。しかしCAR細胞の発生および機能維持における分子機構の多くは未だに不明である。
CAR細胞の由来と考えられる胎児期の軟骨膜周囲の間葉系細胞や血管内皮細胞に着目して遺伝子発現を経時的に比較解析し、CAR細胞特異的遺伝子発現の誘導に重要と考えられるシグナルおよび転写因子の候補をいくつか同定し、それらのfloxマウスを作製した。先行して得られたfloxマウスは各種Creマウスと交配しCAR細胞系列特異的遺伝子欠損マウスを作製し、造血や骨の解析に着手した。いくつかの遺伝子欠損マウスにおいてはCAR細胞の機能に異常（造血幹細胞の維持に必須の遺伝子の発現低下、細胞外マトリクス遺伝子の発現亢進など）を認め、同時に造血の低下（骨髄細胞数・造血幹細胞数の低下）が観察された。現在、in vitroでCAR細胞に強制発現させることなどにより、当該遺伝子の機能解析を進行している。
さらにCAR細胞の成体での維持および再生におけるFoxc1の機能を明らかにするために、Creリコンビナーゼが作用するとFoxc1が発現誘導されるマウスを作製した。現在このマウスを用いてFoxc1の機能を解析するために、造血の低下にCAR細胞のFoxc1の発現低下が随伴するような疾患モデルの条件検討を進行している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CAR細胞の発生メカニズムを明らかにするため、胎児期の軟骨膜の周囲に出現する転写因子osterix(Osx)陽性の間葉系細胞の細分化を試みた。具体的には、Osx-GFPレポータマウスを用いてOsx陽性細胞が軟骨膜にのみ存在する時期(E14.5)および軟骨中央部に侵入した後の時期(E16.5)の四肢より細胞を採取し、フローサイトメータにより解析を行った。E16.5以降ではOsx-GFP陽性細胞がPDGFRβの発現によって亜集団に分けられたことから、ソーティングを行いそれぞれの遺伝子発現を比較した。その結果、Osx-GFP陽性PDGFRβ強陽性細胞分画でFoxc1の発現が有意に高くCAR細胞前駆細胞であると考えられた。次に、より詳細にこれらの細胞分化の変遷を解析するために、E17.5の胎児組織のOsx-Creレポータ陽性分画の細胞をソーティングしシングルセル次世代シーケンスによる遺伝子発現解析を行った。これにより実際に共通の前駆細胞からCAR細胞あるいは骨芽細胞と考えられる細胞へと分化していく様子をクラスター化処理により捉えることができた。これらの解析によりCAR細胞特異的遺伝子の発現を促す可能性のあるシグナル経路および転写制御分子の候補を得た。得られた候補遺伝子について、in vivo機能解析のためにfloxマウスを順次作製しCAR細胞系列特異的遺伝子欠損マウスの解析に着手した。いくつかの遺伝子欠損マウスにおいてはCAR細胞の機能に異常と造血の低下が認められた。
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| Strategy for Future Research Activity |
シングルセル次世代シーケンスによる遺伝子発現解析によって、細胞分化の変遷が細胞集団の遺伝子発現動態として捉えることができるようになった。これまでにE17.5の胎児組織のOsx-Creレポータ陽性分画の細胞をソーティングし解析を行ったが、今後さらにこの前後のタイミングの組織をも用いて経時的な解析を行う。また、血管内皮細胞などの他の重要と考えられる細胞種を排除しない細胞集団での解析も行う。それにより、骨・骨髄発生機構のダイナミズムを明らかにしたい。さらにCAR細胞の機能に異常のあった遺伝子欠損マウスについても同様の解析を行い、当該遺伝子のCAR細胞の発生における機能を明確にしたい。
一方、Creリコンビナーゼが作用した細胞特異的にFoxc1が発現誘導されるマウスを作製した。今後はCAR細胞の造血ニッチ機能の低下と共にFoxc1遺伝子発現低下が顕著に観察されるような疾患モデルにおいて、作製したマウスを用いた場合にCAR細胞の変質の有無や造血の回復が早まるか否かを解析し、CAR細胞の成体での維持および再生におけるFoxc1の機能を明らかにしたい。
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