2020 Fiscal Year Research-status Report
Regulation of light-dependent synthesis of L-ascorbate in plants
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19K06702
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
小竹 敬久 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (20334146)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | GDP-マンノース / VTC1 / KJC1 / ビタミンC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物では、グルコースを初発物質とし、途中GDP-マンノースやGDP-L-ガラクトースを経てビタミンが合成されるD-Man/L-Gal経路がビタミン合成の主要経路である。強光にさらされる植物には、細胞内で生じる活性酸素種の除去にビタミンCが必要で、ビタミンC含量は明暗環境により変化することが知られている。D-Man/L-Gal経路を構成する10反応のうち、律速となっている反応は、マンノース1-リン酸からのGDP-マンノースの合成である。この反応は、VTC1と呼ばれる酵素によって触媒される。またこれまでの研究で、VTC1の活性は、COP9シグナロソームの構成因子であるCSN5Bが関わるタンパク質分解によって制御されることが示唆されている。一方、VTC1と弱い相同性を持つタンパク質KJC1はVTC1と相互作用してその活性を高めることが分かっている。本研究では、KJC1がVTC1の分解を抑制することでその活性を高める、との仮説を立て、VTC1の活性が制御される仕組みの解明を目指している。
2020年度は、FLAG配列のウェスタンブロッティングによりVTC1タンパク質量を定量できるgFLAG-VTC1遺伝子導入シロイヌナズナを利用して、明暗環境の違いによるVTC1の蓄積と、GDP-マンノース合成活性、ビタミンC含量との関係を調べた。暗環境では、ビタミンCの量は半減し、VTC1の蓄積とGDP-マンノース合成活性も低下していた。また、kjc1変異体では、明環境と暗環境いずれにおいても、VTC1の蓄積とGDP-マンノース合成活性が激減していた。これらの結果から、KJC1は明暗に関わらずVTC1の分解を抑制しているがわかった。一方で、明暗による制御にKJC1がどのように関わるかは不明である。そこで、次年度は、明暗環境によるKJC1とVTC1の相互作用の変化について調べる予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究の主な研究内容の一つが、GDP-マンノース合成酵素であるVTC1のタンパク質蓄積レベルの定量である。すでに、FLAG-gVTC1遺伝子を野生型植物、kjc1変異体、kjc2変異体に導入し、それぞれで４ライン以上のトランスジェニックラインを作出している。また、明環境と暗環境でVTC1タンパク質の蓄積量の違いを観察できており、今のところ順調に進んでいる。
FLAG-VTC1導入植物から抗FLAG抗体を用いてVTC1複合体をpull-downする実験では、共沈したタンパク質の中に、VTC1とKJC1が含まれていることをMALDI-TOF/MS/MSで確認できた。一方で、CSN5Bや新規の相互作用因子はまだ検出できておらず、量を増やす、別のpull downを検討することなどが必要である。その一例として、大腸菌で作成した6xHis-VTC1を植物破砕液に大量に混合してVTC1複合体を精製する実験系の構築を進めており、必要に応じて実験内容を微修正する可能性がある。
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| Strategy for Future Research Activity |
VTC1はGTPとマンノース1-リン酸からGDP-マンノースを合成する酵素であり、KJC1は活性を持たないがVTC1に配列相同性をもったタンパク質である。VTC1とKJC1は真核生物で高度に保存され、ヒトでは、GMPPBとGMPPAが相当する。ヒトやマウスでもGMPPBとGMPPAは相互作用しているが、植物でみられるような環境による活性制御は知られていない。また、ヒトのGMPPAに関する研究報告に基づくと、ヒトではGMPPAはGDP-マンノース合成をむしろ抑制しており、植物と動物ではKJC1/GMPPAの働きが逆になっている可能性が高い。本研究では、KJC1がVTC1の分解抑制に働く、との仮説を立てているが、次年度以降は、この仮説をFLAG-gVTC1植物を用いた解析で証明する予定である。
すでに植物ホルモンによる転写調節の多くに、転写抑制因子のユビキチン化とそれに続くプロテアソームによる分解が関わることが示されているが、代謝経路上重要な酵素や輸送体も同様のタンパク質分解制御を受けていることが示されつつある。VTC1の分解制御には、分解に導くCSN5Bとそれを抑制する因子が存在するはずで、本研究ではKJC1がこの働きをもつかを検証する。次年度では、in vitroで合成したVTC1を植物抽出液に添加し、その分解過程を解析する実験を予定している。すでに酵母ツーハイブリッド法の実験でVTC1とKJC1が相互作用することがわかっている。また、FLAG-gVTC1導入植物からVTC1複合体を単離する実験では、この複合体の中にVTC1タンパク質やKJC1タンパク質が含まれることもわかった。しかしながら、VTC1とKJC1それぞれにおける相互作用部位はわかっていない。そこで、酵母ツーハイブリッド法を利用して、VTC1とKJC1それぞれにおいて相互作用に重要な部位の特定を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
VTC1と相互作用する新奇因子の探索作業の一部を次年度に持ち越したため。この実験では、FLAGペプチドが結合したVTC1タンパク質を抗FLAG抗体が結合したビーズで精製し、その後、TOF-MS/MSでタンパク質同定を行うが、精製スケールを大きくして再度行う必要があり、精製キット・分析用試薬などを次年度に購入して実施することとした。
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