2020 Fiscal Year Research-status Report

植物ペプチドホルモンRGFとその受容体を介した根の継続的な成長機構の解明

Research Project

Project/Area Number	19K06705
Research Institution	Nagoya University
Principal Investigator	篠原秀文名古屋大学, 理学研究科, 講師 (40547022)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ペプチドホルモン / 受容体キナーゼ / RGF / リガンド－受容体ペア / 植物
Outline of Annual Research Achievements	植物の根の継続的な成長は，先端から地上部側に向かって存在するPLTタンパク質の濃度勾配が形成・維持されることで保たれるが，濃度勾配の形成・維持の機構は不明な点が多い．近年申請者はペプチドホルモンRGFとその受容体のペアがPLTタンパク質の濃度勾配を制御することを示したが，情報伝達経路の詳細は不明である．申請者は①RGFによるPLTタンパク質の濃度勾配の制御機構の解明のため，PLTタンパク質の濃度勾配を調節する化合物の同定とそのターゲット因子の探索，および②RGF受容体の相互作用因子の探索を行い，各因子の機能解析を通じて，植物の根の継続的な成長のしくみを明らかにすることを目的とし，研究を行っている．当該年度は，①ケミカルライブラリより同定したPLTタンパク質の濃度勾配を正に調節する化合物A01およびA05のターゲット探索を行うため，アフィニティータグとしてビオチンを導入した標識した化合物誘導体の作製を行った．②前年度までに作製したGFP融合RGF受容体の機能的発現株を用いて，抗GFP抗体を用いた共免疫沈降とプロテオミクスを行い，RGF受容体と特異的に相互作用する因子の探索を行った．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason ①RGF受容体変異体中で失われたPLTタンパク質の濃度勾配を回復する低分子化合物のスクリーニングを行い，合計約17,000化合物から，変異体中でPLTタンパク質の濃度勾配を回復させる化合物A01およびA05を同定した．この2つの化合物のターゲット因子の探索のため，構造活性相関解析により置換可能な側鎖に，アフィニティータグのひとつであるビオチンを導入したA01およびA05類縁体の合成を行った．合成したビオチン化A01およびA05の投与実験を行い，双方ともPLTタンパク質の濃度勾配を回復させる活性を維持していることを確認した． ②RGF受容体変異体にGFPを融合させたRGFR1を発現させた植物体を作出し，RGF受容体変異体の根端メリステムが縮小する表現型を相補する株を得た．GFP融合RGF受容体発現シロイヌナズナの根由来のタンパク質抽出液をサンプルとして抗GFP抗体を処理し，Protein Aビーズによる共免疫沈降を行った．コントロールとしてGFP単体を過剰発現したシロイヌナズナを用いた．双方の沈降画分のプロテオミクスを行い，得られたデータの差分をとることで，RGF受容体と特異的に相互作用する候補タンパク質を複数同定した．
Strategy for Future Research Activity	①作製したビオチン導入A01およびA05誘導体を用いたプルダウン解析を行う．シロイヌナズナ根由来のタンパク質抽出液をサンプルとして，ビオチン導入誘導体を作用させ，アビジンビーズでプルダウンを行う．共沈画分のプロテオミクスを行い，化合物と特異的に相互作用する因子の同定を試みる．化合物の相互作用タンパク質の候補が同定され次第，候補遺伝子の過剰発現株，変異株の作出と表現型観察，発現部位の解析，および化合物との結合実験などを進める． ②共免疫沈降によって得られた相互作用因子候補の機能解析を行う．特にRGF受容体と相互作用する可能性の高い膜タンパク質を優先してピックアップし，候補遺伝子の変異株の作出と根における表現型観察，根での発現部位の解析を行う．またBiFC解析等により，RGF受容体との相互作用確認を進める．
Causes of Carryover	（次年度使用額が生じた理由）ビオチン化化合物誘導体合成には種々の条件検討が必要と考えていたが，予想より簡便に合成が完了できたため，比較的高価な合成試薬の購入費が当初予定していた額を下回ったため．（使用計画）ビオチン化化合物を用いたプルダウン実験のために比較的高価な磁性アビジンビーズを数種類試用する必要があるため，アビジンビーズの購入費に充てる．またRGF受容体を用いた共免疫沈降実験をより効果的に行うため，より機能的な抗GFP抗体および磁性Protein Aビーズの購入費に充てる．