2019 Fiscal Year Research-status Report
単細胞緑藻クラミドモナスにおけるmiRNAシステムの分子基盤解明
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19K06710
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| Research Institution | Kochi University |
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Principal Investigator |
山崎 朋人 高知大学, 教育研究部自然科学系理工学部門, 助教 (70512060)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | miRNA / クラミドモナス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
miRNAによる遺伝子発現制御の仕組みは動植物の共通祖先となった単細胞生物が獲得し、進化の過程でその作動様式をダイナミックに変化させながら様々な生命現象を制御する役割を獲得してきたと推測されている。その始原の姿はどのようなものだったのか、また、進化とmiRNA機能の多様化をより深く理解するため、本研究では解析の進んでいない単細胞生物の中でも特に単細胞緑藻クラミドモナスに着目して研究を行う。
具体的には、miRNAの整合性に必須な２本鎖RNA結合たんぱく質DUS16と相互作用するタンパク質群、ならびにmiRNAの作用に必須なAGO3タンパク質と総合作用するタンパク質群を、それぞれタンパク質複合体を精製し、質量分析を行って同定する。
miRNAが作用する遺伝子を同定するため、CLIP-seqを行う。さらにはレポーター遺伝子を用いてランダム挿入変異ライブラリーを構築し、miRNAの機能しない突然変異体の単離・解析を行う。
本年度は、まず DUS16タンパク質複合体、AGO3タンパク質複合体の精製条件の決定と、タンパク質複合体の質量分析を完了させた。その結果、DUS16と結合する７種類のタンパク質が同定された。中にはRNAと相互作用を示す可能性のあるものも含まれていた。またAGO3と結合する34種類のタンパク質が同定された。中にはRNAとの相互作用を示す可能性のあるものに加え、リボソームタンパクが複数種類あり、miRNAによる翻訳阻害との関与が示唆された。
こうした解析の結果、miRNAの生合成や作用に関わるタンパク質複合体の構成因子が明らかとなった。こうしたタンパク質の機能を今後解析することで、クラミドモナスにおけるmiRNAの分子基盤解明に迫る第一歩となると期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
細胞内でmiRNAが作られるメカニズムを解明するため、クラミドモナスのmiRNA生合成に必須なDUS16タンパク質複合体を精製し、タンパク質質量分析を行った。その結果、RNA結合タンパクやRNA helicase等の、クラミドモナスではmiRNAとのかかわりが明らかでない7種類のタンパク質のDUS16との結合が明らかとなった。
細胞内でmiRNAが作用するメカニズムを解明するため、miRNAの作用に必須なAGO3タンパク質複合体を精製し、タンパク質質量分析を行った。その結果、RNA結合たんぱく質やリボソームタンパクなど、クラミドモナスではmiRNAとのかかわりが明らかでない34種類のたんぱく質のAGO3との結合が明らかとなった。
このように、当初の計画通りに研究を進め、miRNAの分子基盤解明につながる知見が得られたことから、本研究は順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
DUS16、AGO3との相互作用が明らかとなったタンパク質のうち、そのアミノ酸配列の相同性からRNAに作用する機能を持つと予測されるたんぱく質、リボソームタンパク質を解析対象とし、これらのタンパクをコードする遺伝子の突然変異体を解析する。
具体的には、変異体はクラミドモナス変異体ライブラリーから購入、ライブラリーにない変異体はゲノム編集によって作り出す。こうした変異体において、miRNAの生合成、標的遺伝子の抑制効果に異常がないかどうかを丹念に解析する予定である。
またmiRNAの標的遺伝子を探し出すため、HITS-CLIP法をクラミドモナスに適用するべく、その条件検討を行って実験系を確立し、次世代シークエンサー解析によってmiRNAの標的遺伝子を同定する。
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Research Products
(2 results)
