2020 Fiscal Year Research-status Report
植物の長鎖非コードRNAが関わる感染防御機構：RNA結合因子からのアプローチ
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19K06711
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| Research Institution | Nagoya City University |
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Principal Investigator |
湯川 泰 名古屋市立大学, 大学院理学研究科, 教授 (70381902)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 長鎖非コードRNA / シロイヌナズナ / RNAポリメラーゼIII / 感染防御 / ストレス応答 / RNA結合タンパク質 / 種子形成 / サリチル酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞中には多様な非コート RNA (ncRNA) が存在する。その中で200 塩基を超えるものは長鎖非コート RNA (lncRNA) と呼ばれ、多くの機能解明が急がれる。申請者はRNAポリメラーゼ III による転写に着目し、シロイヌナズナから発現量が高く興味深いAtR8 lncRNAを発見した。RNAポリメラーゼ III はハウスキーピング遺伝子を転写するとされるが、AtR8 lncRNA は低酸素とサリチル酸(植物ホルモン)に応答する特徴があった。さらにAtR8 lncRNA遺伝子の欠損変異体を用いたマイクロアレイ解析では、AtR8 lncRNAの感染防御およびストレス応答への関連が強く示された。
以下の3つの目的を定めた。【目的1】AtR8 lncRNA結合タンパク質の同定、【目的2】AtR8 lncRNAの種子形成に関わる機能解析、【目的3】AtR8 lncRNA遺伝子のサリチル酸応答メカニズムの解明、である。
【目的2】に関して、AtR8 lncRNAが未熟種子にも多量に蓄積することを見出し、in situ ハイブリダイゼーション法で未熟種子における局在を明らかしにした。令和2年度は【目的3】に関して、感染防御に関わりの深いWRKY転写因子遺伝子の発現がAtR8 lncRNA遺伝子発現と明白な逆相関を示すことに関して、その制御機構について研究を進めた。In vitro転写系を用いた解析の結果、サリチリ酸応答シス配列のas-1がAtR8 RNA遺伝子とWRKY遺伝子を制御する知見を得ることができた。
また、AtR8 RNA遺伝子の168 bp上流という極めて近傍にAtGSTU7遺伝子が存在し、種子の発芽率に影響することを、BBRC誌に発表した。AtR8 RNAも種子の発芽率に影響するため極めて興味深い。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
令和2年度当初から始まったコロナ禍で研究の停滞が余儀なくされ、予定していた結合タンパク質同定作業に着手できなかった。代わりに、AtR8 lncRNAと根の伸長機能に関する研究を進めた。低濃度のサリチル酸存在下では、シロイヌナズナ発芽種子の根は伸長が著しく阻害される。配偶子形成に関して、雌しべ(柱頭)の活性酸素分子種 (ROS) 蓄積が高いことが知られているため、AtR8 lncRNAとの共局在を調べた。また、AtR8遺伝子およびWRKY遺伝子のサリチル酸応答発現を解析する目的で、それぞれの遺伝子上流に位置するサリチル酸応答配列as-1を変異した遺伝子を作成し、タバコのin vitro転写系および培養細胞を用いたin vivo解析系を使って発現解析を行った。動物細胞によく使われるトランスフェクション試薬であるPolyethylene imine (PEI) を用いて、植物プロトプラストによる一過的発現解析を試みた。as-1配列の両側にレポーター遺伝子を配置して、その制御を調べた。変異遺伝子のクローニングが想定外に困難で時間を要したが、as-1配列依存的な転写制御がみられ研究をさらに進めている。
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| Strategy for Future Research Activity |
計画初年度からの実施を予定していたRNA結合タンパク質の同定作業に本格的に着手する。変異体やマイクロアレイを用いた解析では、AtR8 RNAの機能がおぼろげながら見えてきた。RNA結合タンパク質の同定により、機能に関してより大きな発見がもたらされると期待できる。本研究の残り期間の中心的な課題として進める。本研究は博士後期課程学生1名と代表者が担当する。
AtR8 lncRNA遺伝子のサリチル酸応答機構の解明については、in vitro解析を完了させ、引き続き植物培養細胞を使ったin vivo解析によって検証を進め、研究成果を論文にまとめる。この研究は、研究員1名と代表者が担当する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルスの流行による影響で研究時間を十分に確保できず、RNA結合タンパク質の研究が本格的に開始できなかったため。次年度にRNA結合タンパク質関連の研究を集中的に使用して行う。また、進捗によっては研究期間の延長を視野に入れている。
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