2020 Fiscal Year Research-status Report
シアノバクテリアのパートナースイッチング制御系による環境応答機構の解明
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19K06717
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| Research Institution | Saitama University |
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Principal Investigator |
日原 由香子 埼玉大学, 理工学研究科, 教授 (60323375)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | シグナル伝達 / シアノバクテリア / 順化応答 / PmgA / リン酸化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シアノバクテリア Synechocystis sp. PCC 6803 (S.6803)においては、パートナースイッチング制御系のアンチσ因子と相同性を持つPmgAタンパク質が、強光下や光混合栄養条件下での生存に必須である。本研究では、PmgAのリン酸化標的として、パートナースイッチング制御系のアンタゴニスト様タンパク質Ssr1600を同定したことから、「パートナースイッチング制御系はいかにして、シアノバクテリアの光合成や代謝を制御しているのか？」の解明を目指している。当該年度は、S.6803ゲノムにコードされているアンチσ因子様タンパク質PmgA、Slr1861、およびアンタゴニスト様タンパク質Ssr1600、Slr1856、Slr1859、Slr1912間の相互作用解析を行った。①バクテリアtwo-hybrid法（BACTH system）を用いて、アンチσ因子様タンパク質とアンタゴニスト様タンパク質の相互作用の有無、ホモ二量体・ヘテロ二量体形成の有無、およびSsr1600のリン酸化セリン残基を置換した場合のPmgAとの相互作用への影響を評価した。②上記４種のアンタゴニスト様タンパク質をS.6803粗抽出液に加えるプルダウン解析により、これらのアンタゴニストオルソログとPmgAの相互作用を評価した。以上の解析結果より、S.6803細胞内でパートナースイッチング制御系の構成因子がクロストークし、複雑なシグナル伝達経路を構成していることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①γ-32P ATPを用いたリン酸化実験では、PmgAはアンタゴニスト様タンパク質のうちSsr1600のみを特異的にリン酸化する結果が得られたが、BACTH systemを用いてPmgAとの相互作用活性を評価したところ、Ssr1600、Slr1856、Slr1859ではポジティブコントロールの4倍以上もの高い活性が、Slr1912もポジティブコントロールと同等の活性が検出された。さらに、アンチσ因子様タンパク質PmgAとSlr1861間でホモ二量体・ヘテロ二量体を形成し得ること、Ssr1600はホモ二量体およびSlr1912とのヘテロ二量体を形成し得ることが示された。Ssr1600のリン酸化部位である59番目のセリンをアラニンまたはアスパラギン酸に置換することで脱リン酸化状態、リン酸化状態を模倣し、PmgAとの相互作用を解析したところ、野生型とS59A型がポジティブコントロールより高い活性を示したのに対し、S59D型ではネガティブコントロールと同レベルの活性であったことから、一般的なパートナースイッチング制御系のアンタゴニストと同様、Ssr1600は脱リン酸化型のときにPmgAと相互作用し、リン酸化されると相互作用が失われると考えられた。②N末にHisタグを付加した４種のアンタゴニスト様タンパク質をS.6803粗抽出液に加えて相互作用させた後に、アフィニティー精製するプルダウン解析を行った。各溶出画分についてイムノブロット解析を行ったところ、His-Slr1856とHis-Slr1859を加えた場合のみPmgAのバンドが検出された。PmgAのリン酸化標的であるHis-Ssr1600の添加によってはPmgAが共精製されなかった事実は、添加したHis-Ssr1600をPmgAがリン酸化することにより相互作用が阻害されている事実を示しているかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
２種の相互作用解析の結果から、S.6803細胞内でアンチσ因子様タンパク質とアンタゴニスト様タンパク質間に複雑な相互作用が存在することが示唆された。PmgAの特異的リン酸化標的はSsr1600であると考えられるが、他のアンタゴニスト様タンパク質がPmgAと相互作用することにより、PmgAとSsr1600の相互作用に影響を与えるなど、パートナースイッチング制御系間のクロストークが予想される。今後はPmgAや各アンタゴニスト様タンパク質の欠損株や過剰発現株について、これまでにPmgA欠損株で表現型が観察されている強光下や光混合栄養条件下での表現型や、各因子の細胞内での存在状態を調べることにより、in vivoでパートナースイッチング制御系が実際にクロストークしているのか、そのクロストークに一体どのような生理的意義があるのかを解析していきたい。また、パートナースイッチング制御系の構成因子として、アンチσ因子とアンタゴニストに加え、アンタゴニストを脱リン酸化するPP2C型ホスファターゼが存在することが知られている。S.6803ゲノムにコードされている3種のホスファターゼ候補の組換えタンパク質を調製し、Ssr1600に対する脱リン酸化活性を評価することで、PmgAとSsr1600とともにパートナースイッチング制御系を構成するホスファターゼを同定したい。
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| Causes of Carryover |
当該年度はタンパク質間相互作用解析に注力したため、シアノバクテリアの遺伝子欠損株や過剰発現株を用いた表現型解析に必要な額を次年度に持ち越した。翌年度分の助成金と合わせ、転写産物やタンパク質レベルでの発現解析等に使用する予定である。
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