2020 Fiscal Year Research-status Report
細胞種特異的ヒストン修飾解析系を用いた脱分化をもたらすエピジェネテクスの解明
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19K06748
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| Research Institution | Tokyo University of Science |
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Principal Investigator |
坂本 卓也 東京理科大学, 理工学部応用生物科学科, 講師 (40637691)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | エピジェネティクス / 遺伝子発現制御 / ヒストン修飾 / RNAポリメラーゼII |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、植物個体で、マウス由来の修飾特異的細胞内抗体と蛍光プローブを用いた修飾バイオセンサーModification-specific intracellular antibody（mintbody）を利用したヒストン修飾を検出する新規イメージング及び生化学的手法を確立し、植物組織の特定細胞が脱分化する際のヒストン修飾を介したエピジェネティック制御を捉えることを目的としている。
本研究では、転写活性化マークH3K9ac、H3K4me3、及び転写抑制化のマークH3K27me3に着目した。また、当初の計画に加えて、エピジェネティック制御のアウトプットである転写活性化状態を表すRNAポリメラーゼIISer2（PolIISer2）のリン酸化修飾にも着目した。単一プロモーター制御下でこれらmintbodyクローンと融合したGFP及びmRubyを融合したヒストンH2Bを発現する形質転換植物体を作成した。このシステムでは、核におけるGFP/mRubyの蛍光強度比を測定することで、修飾レベルを定量できる。これまでに、イメージング解析及び生化学的解析によりPolIISer2及びH3K4me3に関してはターゲットを正しく認識し、修飾レベルに応じた挙動を示すことを証明した。これらのmintbodyを用いたイメージング解析により、根の細胞種によって修飾レベルが異なる様子や、植物の脱分化・再分化の過程において個体レベルで修飾レベルが変化する様子を検出することができた。また、PolIISer2のmintbody-GFPに関してはGFP抗体を用いたChIP-seqに利用可能であることを示すことができ、細胞種特異的プロモーターを利用してChIP-seqを行うことで、特定細胞におけるPolIISer2レベルの検出が可能となると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
昨年度に引き続き、H3K9ac及びH3K27me3のmintbodyについて、阻害剤処理への期待される応答が確認できていない。これらのmintbodyについては、植物体で発現させる際のプロモーターの変更やGFP融合位置やGFP融合の際のリンカー配列を調整するなどして、適切に反応するmintbodyを発現する形質転換植物体の単離・作成が必要である。また、PolIISer2のmintbodyでは成功したが、H3K4me3のmintbodyでは、未だmintbodyを標的としたクロマチン免疫沈降に成功していない。そのため、細胞種特異的にmindbodyを発現する形質転換植物体への着手が遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
H3K9ac及びH3K27me3のmintbodyについては、植物体で発現させる際のプロモーターの変更やGFP融合位置やGFP融合の際のリンカー配列を調整するなどして、適切に反応するmintbodyを発現する形質転換植物体の単離・作成を行う。H3K4me3のmintbodyについては、mintbodyを標的としたクロマチン免疫沈降を行う際に、DNA切断を超音波による切断ではなく、DNA切断酵素を利用した方法にするなど、引き続きクロマチン免疫沈降の条件検討を進める。また、同時に、細胞種特定的プロモータを利用した、mintbody発現形質転換植物体の作成に着手する。
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