2019 Fiscal Year Research-status Report
Investigation for regulatory mechanisms of cnidarian muscle contraction
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19K06755
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
田中 啓之 北海道大学, 水産科学研究院, 助教 (90241372)
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2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | 筋肉 / クラゲ / 筋収縮調節 / リン酸化 / カルシウムイオン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
令和元年度の研究成果のうち、重要なものは以下の3つである。
（１）ミズクラゲの傘の小片を海水中に置き、通電して刺激すると強く収縮した。弛緩状態から電気刺激パルスを繰り返し与えた場合、最初の収縮は弱く、2回目以降の収縮は強い傾向が見られた。また、メントールを海水に添加すると、刺激を与えても全く反応が見られないことから、電位作動性Ca2+イオンチャネルの開口が筋収縮を引き起こしていると示唆された。
（２）ミズクラゲの傘をホモジナイズしてSDS-PAGEに供し、Phos-Tag Cyanによる染色を行ってリン酸化タンパク質を探索した。その結果、アクトミオシンの構成成分として既に報告したSer/Thr-キナーゼが高度にリン酸化されていることが示された。さらに、電気刺激を与えて収縮状態にある傘と、メントール飽和海水に浸して弛緩状態にある傘からホモジェネートを調製して調べると、収縮状態ではSer/Thr-キナーゼのリン酸化レベルが低下していることが示された。従って、Ser/Thr-キナーゼのリン酸化・脱リン酸化が収縮調節に関連している可能性が考えられた。
（３）ミズクラゲの傘に新規のEF-hand型Ca2+結合タンパク質（AaCBP）を見出し、cDNAをクローニングした。このタンパク質のアミノ酸配列はカルモジュリンと約40%の相同性を示し、Ca2+を結合するのは最もN端側のSite Iのみであると推測された。cDNAを元に、組換えAaCBPを大腸菌発現・精製し、蛍光滴定によってCa2+結合定数を測定したところ、3.1E+05と見積もられ、このタンパク質が細胞内Ca2+濃度変化を検出し、筋収縮を制御する機能に関与できると推測された。また、組換えAaCBPをウサギに免疫して得られた抗体でウェスタンブロッティングを行い、AaCBPの主要な発現部位が傘であることを確認した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ほぼ実施計画通りの研究を進められたため。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）種々の薬理活性物質がクラゲの筋収縮に及ぼす効果の検討をさらに進める。特に、平滑筋しか含まないポリプやクラゲの口腕について、薬理活性物質による収縮または弛緩状態を作り出し、それぞれの状態におけるタンパク質のリン酸化状態の解析を行って、傘（横紋筋）についての結果と比較する。
（２）ミズクラゲの各種筋肉タンパク質に対する抗体の作製を進め（既にSer/Thr-キナーゼ、トロポミオシン2ならびにAaCBPについては作製済み）、ウェスタンブロッティングや免疫染色によって、これらのタンパク質の存在部位や発現ステージを解析して、役割の解明に繋げる。
（３）酵母Two-Hybrid systemによるインタラクトーム解析に着手し、各種筋肉タンパク質が相互作用する相手を明らかにすることで、タンパク質-タンパク質間相互作用の変化が筋肉の収縮と弛緩を制御する仕組みを解明する。
（４）（１）から（３）の結果から推測できる筋収縮調節機構を検証するため、筋組織から単離精製または大腸菌発現によって調製した個々のミズクラゲ筋肉タンパク質について、試験管内で機能を解析する。例えば、再構成アクトミオシンのMg-ATPase活性を阻害または活性化する効果を測定することで、アクチンとミオシンの相互作用を抑制または促進する機能を確認する。また、共沈実験によってアクチンやミオシンに対する結合性の有無や、結合強度を測定する。さらに、AaCBPについては、免疫沈降法によってCa2+依存的に結合するタンパク質を同定し、AaCBPが担う細胞内情報伝達の様式を明らかにする。
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| Causes of Carryover |
令和元年度は、一部の実験装置を自作するなどして出費を抑えた結果、次年度使用額が発生した。次年度は、比較的高価な備品と試薬キット類を購入予定であり、次年度使用額は令和2年度の物品費に合一して使用し、研究計画の推進を図る。
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