ヌタウナギにおける染色体放出ではDNA鎖内部領域欠失・再結合はおこなわれているか

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06783
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 久保田 宗一郎 東邦大学, 理学部, 教授 (30277347)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 友二 東邦大学, 理学部, 准教授 (70362522)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ヌタウナギ / ゲノム再編成 / 染色体放出 / DNA鎖内部欠失 / NGSデータ / リシークエンス

Outline of Annual Research Achievements

科研費申請時には、まず検出されているID領域の大きさの違いで区切った塩基配列のデータベースをいくつか構築した後、以下の３つの作業目標を設けた；１．大きさに分けた幾つかの配列について、その領域が本当にEゲノムに相当するのかを、S、G両ゲノムDNAを鋳型にしたPCRで検証し、またその領域の染色体上の位置をFISH解析で特定する、２． 塩基配列を詳細に解析し、遺伝子等の分布や既知の転位因子との相同性等を解析する、３． 個体によってID領域に差がないのかを、上記１の工程で確認し、必要なら関連領域についてのリシーケンシングをNGSによって行い、データの信憑性を検証する。
初年度は、まず作業目標１に沿って、SゲノムにおいてEゲノムの上下流が再結合したと考えられるS-（Sゲノム由来）scaffoldとそれに対応するGゲノムの配列をランダムに抽出し比較解析した結果、再結合の様式は概ね３通りに分類された。また同時に再結合が確認された複数のG-（Gゲノム由来）scaffold配列を基にEゲノムの上・下流を増幅する複数のPCR解析を行った結果、GゲノムからだけでなくSゲノムDNAからも増幅されるケースあることから、ID領域に細胞間、個体間での違いが存在する可能性が強く示唆された。また、実際に複数個体のゲノムDNAを用いた検証実験でもID領域の個体差が明確になった。そこで個々のID領域についてのPCRによる検証は時間と手間が掛かり多くを処理することが難しいこと、さらに解析に用いる領域がユニークでない場合、解析結果が安定しないこと等の問題点が明らかとなった。そこで上記の作業目標1の途中であったが、３に掲げたリシーケンシングを複数個体、複数組織で行うことしたが、予算に限度もあり、初年度はまずは同一個体由来のSゲノムとGゲノムの２検体についてのみ受託解析にリシーケンスを依頼した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度は、まず作業目標１の準備段階として、SゲノムにおいてEゲノムの上下流が再結合したと考えられる40のS-scaffoldとそれに対応するGゲノムの配列をランダムに抽出し比較解析した結果、再結合の様式は概ね３つあることが判明した。その内訳は、① Eゲノムが放出され、その上下流の配列が直接再結合しているものが８、② Gゲノム中では、Eゲノムの上下流に10数塩基の同一配列が１コピーずつ存在しているのに対し、対応するSゲノムでは、Eゲノム欠失後にこの配列も１コピーに減少し再結合している様式が10、③ Eゲノムの上下流配列の再結合境界に数塩基の挿入配列が存在している様式が22であった。また、Eゲノムの上下流端、あるいはEゲノムの外側の再結合領域の10数塩基について特異的な塩基配列は検出できなかった。加えて、再結合が確認された複数の領域について、Eゲノムの上・下流を増幅するPCR解析を行った結果、GゲノムからだけでなくSゲノムからもID領域が増幅される場合もあることから、ID領域に細胞間、個体間での違いの存在が強く示唆された。更に同じ様な塩基配列を持つID領域がゲノム内に多コピー存在する可能性も併せて示唆された。
そこで新たにヌタウナギ３個体のG・Sゲノムを鋳型に、上述の①タイプのIDを行うと推定される６つのG-scaffoldの配列におけるPCR解析を試みた。その結果、少なくても４つのG-scaffoldでは、Gゲノム内にEゲノム領域の増幅が確認された一方、Sゲノム内の相当領域の増幅には個体による違いが検出された。この結果からID領域の有無に個体差がある可能性を強く示唆している。このため研究遂行上極めて重要となったため、作業目標３の複数個体のリシーケンスに着手することとし、まず１個体のSゲノムとGゲノムの２検体について受託解析にリシーケンスを依頼した。

Strategy for Future Research Activity

初年度は最終的には１個体のSゲノムとGゲノムの２検体についてリシーケンスを行ったが、更に数個体についてリシーケンスを行なってデータに厚みを作らないと、データを基にしたEゲノムの推定（情報解析）によるより信憑性の高いID領域を導き出すことは難しいと考える。しかし、本基盤研究(C)の助成金だけでは追加のリシークエンスの個体数・組織数をあまり増やせないこと、またその決定した塩基配列の解析も、民間の受託解析より、経験豊富な研究チームに支援が不可欠であると思われる。そこで文部科学省科学研究費助成事業「新学術領域研究（学術研究支援基盤形成）の「先進ゲノム解析研究推進プラットフォーム（略称：先進ゲノム支援）」へ申請を行い、研究支援による研究・解析体制の充実を図りたいと考え、現在申請の準備中である。
また、現在までに解析に着手したID領域に関しては、リシーケンスの進行とは別個に並行して詳細なFISH解析を行い、ID領域が、染色体放出によって体細胞から失われている16本の染色体上に座するものではなく、生殖細胞においては捨てられない36本の染色体上に存在するが、体細胞におけるこの36本の染色体上には座していないことを明らかにする。更に、より詳細な解析により、ID領域が座する染色体は、36本の染色体の内の何本かに限定されているのか、ID領域は広く分散し36本の染色体に散りばめられているのかを検証することにより、ヌタウナギの染色体放出における内部欠失型のゲノム再編成の実態や機序、意義などの解明に繋げていく予定である。