ヌタウナギにおける染色体放出ではDNA鎖内部領域欠失・再結合はおこなわれているか

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06783
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 久保田 宗一郎 東邦大学, 理学部, 教授 (30277347)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 友二 東邦大学, 理学部, 准教授 (70362522)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ヌタウナギ / ゲノム再編成 / 染色体放出 / DNA鎖内部欠失 / NGSデータ / リシーケンス

Outline of Annual Research Achievements

科研費申請時には、まず検出されているID領域の大きさの違いで区切った塩基配列のデータベースをいくつか構築した後、以下の３つの作業目標を設けた；１．大きさに分けた幾つかの配列について、その領域が本当にEゲノムに相当するのかをS、G両ゲノムDNAを鋳型にしたPCRで検証し、またその領域の染色体上の位置をFISH解析で特定する、２． 塩基配列を詳細に解析し、遺伝子等の分布や既知の転位因子との相同性等を解析する、３． 個体によってID領域に差がないのかを上記１の工程で確認し、必要なら関連領域についてのリシーケンシングをNGSによって行いデータの信憑性を検証する。
初年度は、まず作業目標１に沿って、SゲノムにおいてEゲノムの上下流が再結合したと考えられるS-（Sゲノム由来）scaffoldとそれに対応するGゲノムの配列をランダムに抽出し比較解析した結果、再結合の様式は概ね３通りに分類された。同時に再結合が確認された複数のG-（Gゲノム由来）scaffold配列を基にEゲノムの上・下流を増幅するPCR解析も行った結果、GのみならずSゲノムDNAからも増幅されるケースあることから、ID領域に細胞間、個体間での違いが存在する可能性が強く示唆された。そこで上記作業目標1の途中であったが、３に掲げたリシーケンシングを複数個体、複数組織で行うこととした。予算の都合上、まずは同一個体由来のSとGゲノムの２検体についてのみ受託解析に依頼した。
今年度は新型コロナ・ウイルス蔓延に伴う入構規制等で、研究活動は実質休眠状態を強いられた。一方、本研究課題について研究支援による研究解析体制の充実を目的に文部科学省科学研究費助成事業「先進ゲノム支援（詳細後述）」へ申請、採択された。先進ゲノム支援チームの助言に従い、前年度のリシーケンス・データの情報解析をチームに依頼、また次年度以降の研究遂行手順を協議した。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

初年度冒頭に行った予備的解析結果から、ID領域に細胞間、個体間での違いの存在が示唆され、更に同じ様な塩基配列を持つID領域がゲノム内に多コピー存在する可能性も併せて示唆されたため、作業目標１、２の前に３の複数個体のリシーケンスに着手することが研究遂行上極めて重要となった。そこで、まず１個体のSゲノムとGゲノムの２検体についてのリシーケンスを行った。予算の都合上、初年度に行ったリシーケンスは１個体のS、Gゲノムの２検体についてのみであったが、複数個体についてリシーケンスを行なってデータに厚みを持たせないと、Eゲノムの推定（情報解析）によるより信憑性の高いID領域を導き出すことは難しいと考えられた。しかし、本基盤研究(C)の助成金だけでは追加のリシークエンスの個体数や組織数をあまり増やせないこと、またその決定した塩基配列の解析も、民間の受託解析より、経験豊富な研究チームに支援が不可欠であると思われた。そこで、研究支援による研究・解析体制の充実を図るべく、文部科学省科学研究費助成事業「新学術領域研究（学術研究支援基盤形成）の「先進ゲノム解析研究推進プラットフォーム（略称：先進ゲノム支援）」へ申請を行い（８月）、採択された（11月中旬）。
先進ゲノム支援チームとの打ち合わせ（オンライン）の結果、新規に抽出し直した個体のSゲノムとGゲノムの２検体のLong-read（ロングリード）によるドラフト・ゲノム再構築を一度行い、リシーケンス・データも同様に新規に抽出し直した別個体のDNA資料から行うこととし、年度内は前年度のリシーケンス・データの情報解析を先進ゲノム支援チーム依頼した。
今年度は前年度３月からの新型コロナ・ウイルス蔓延に伴う入構規制等の影響で、研究活動に費やせる時間がほとんどなく、研究は言わば休眠状態であった。そのため、今年度予算も執行も全くできなかった。

Strategy for Future Research Activity

まずは、新型コロナ・ウイルス蔓延による緊急事態宣言下ではあるが、新たにヌタウナギを採集する必要がある。作業目標３にあげたリシーケンスを想定して、初年度（2019年度）にヌタウナギを採集した折、５個体以上についてGゲノム（精巣）に加えSゲノムとして複数組織のDNA資料を作成していたが、先進ゲノム支援チームの助言に沿って、５月には新規に抽出した個体のSゲノムとGゲノムの２検体を準備する。引き続きLong-read（ロングリード）によるドラフト・ゲノム再構築を支援チームに依頼する一方、リシーケンス・データも同様に新規に抽出し直した別個体のDNA資料から作り直し、初年度のリシーケンス・データの情報解析と並行して先進ゲノム支援チームにリシーケンスとそのデータの情報解析を依頼する。
また、現在までに解析に着手したID領域に関しては、新たに検出されるであろうID領域と並行して詳細なFISH解析を行い、ID領域が、染色体放出によって体細胞から失われている16本の染色体上に座するものではなく、生殖細胞においては捨てられない36本の染色体上に存在するが、体細胞におけるこの36本の染色体上には座していないことを明らかにする。更に、より詳細な解析により、ID領域が座する染色体は、36本の染色体の内の何本かに限定されているのか、ID領域は広く分散し36本の染色体に散りばめられているのかを検証することにより、ヌタウナギの染色体放出における内部欠失型のゲノム再編成の実態や機序、意義などの解明に繋げていく予定である。
一方、今年度は新型コロナ・ウイルス蔓延に伴う入構規制等の影響で、研究活動に費やせる時間がほとんど無かったため、当初研究期間とした３年間の真ん中の１年間は具体的なデータを積むことはできなかった。そこで研究課題の目標を達成するためには、１年間の期間延長の申請は必須と考えている。

Causes of Carryover

今年度は前年度３月からの新型コロナ・ウイルス蔓延に伴う入構規制等の影響で、研究活動に費やせる時間がほとんどなく、研究は言わば休眠状態であった。そのため、今年度予算も執行も全くできなかった。
今年度予算は、次年度と一緒に使用する予定であるが、研究課題の目標を達成するためには、１年間の期間延長の申請は必要と考えている。