ヌタウナギにおける染色体放出ではDNA鎖内部領域欠失・再結合はおこなわれているか

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06783
• Research Institution: Toho University
• Principal Investigator: 久保田 宗一郎 東邦大学, 理学部, 教授 (30277347)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 後藤 友二 東邦大学, 理学部, 准教授 (70362522)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: ヌタウナギ / ゲノム再編成 / 染色体放出 / DNA鎖内部欠失 / NGSデータ / リシーケンス

Outline of Annual Research Achievements

科研費申請時には、まず検出されているID領域の大きさの違いで区切った塩基配列のデータベースをいくつか構築した後、以下の３つの作業目標を設けた；１．大きさに分けた幾つかの配列について、その領域が本当にEゲノムに相当するのかをS、G両ゲノムDNAを鋳型にしたPCRで検証し、またその領域の染色体上の位置をFISH解析で特定する、２．塩基配列を詳細に解析し、遺伝子等の分布や既知の転位因子との相同性等を解析する、３．個体によってID領域に差がないのかを上記１の工程で確認し、必要なら関連領域についてのリシーケンシングをNGSによって行いデータの信憑性を検証する。
初年度は、作業目標１に沿って、SゲノムにおいてEゲノムの上下流が再結合したと考えられるS-（Sゲノム由来）scaffoldとそれに対応するGゲノムの配列をランダムに抽出し比較解析した結果、再結合の様式は概ね３通りに分類された。同時に再結合が確認された複数のG-（Gゲノム由来）scaffold配列を基にEゲノムの上・下流を増幅するPCR解析も行った結果、GのみならずSゲノムDNAからも増幅されることがあり、ID領域に細胞間、個体間での違いが存在する可能性が示唆された。そこで作業目標３のリシーケンシングを複数個体で行うことを先行させ、まずは同一個体由来のSとGゲノムの２検体について受託解析に依頼した。２年目は研究が休眠状態を強いられたが、本研究課題について文科省科研費助成事業「先進ゲノム支援」へ申請、採択された。先進ゲノム支援チームの助言に従い、前年度の受託解析データの情報解析をチームに依頼、また研究遂行手順を協議した。
今年度は、新規に採集した個体組織から同一個体由来のSとGゲノムのLong-readでのゲノム再構築を最新のNGS解析機器を用いて行い、新たなドラフト・ゲノムの構築と、個体差確認用のデータも得ることとした。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

初年度冒頭に行った予備的解析結果から、ID領域に細胞間、個体間での違いの存在が示唆され、更に同じ様な塩基配列を持つID領域がゲノム内に多コピー存在する可能性も併せて示唆されたため、先に作業目標３の複数個体のリシーケンスに着手することが研究遂行上極めて重要となった。そこで、まず１個体のS並びにGゲノムの２検体についてのリシーケンスを行った。予算の都合上、初年度のリシーケンスは１個体２検体についてのみであったが、複数個体について実施しデータに厚みを持たせないと、Eゲノムの推定（情報解析）によるより信憑性の高いID領域を導き出すことは難しい予想された。しかし、本基盤研究(C)の助成のみでは追加のリシークエンスもままならないこと、またその決定した塩基配列の解析も、経験豊富な研究チームに支援が不可欠であると思われた。そこで、2020年度は新型コロナ・ウイルス蔓延に伴う入構規制等で研究は休眠状態であったが、研究支援による研究・解析体制の充実を図るべく、文科省科研費助成事業「新学術領域研究（学術研究支援基盤形成）の「先進ゲノム解析研究推進プラットフォーム（略称：先進ゲノム支援）」へ申請を行い、採択されたため、まずは前年度のリシーケンス・データの情報解析を支援チーム依頼した。
今年度は、支援チームとの打ち合わせを重ね、新規に抽出し直した個体のSゲノムとGゲノムの２検体のLong-readによるドラフト・ゲノム再構築を行い、リシーケンス・データも同様に新規に抽出し直した別個体のDNA資料から行うこととした。６月に新規採集した成熟個体の組織を国立遺伝学研究所の支援チームに送り、10月に１個体分（血液、精巣）のLong-readデータ、２個体分のshort-readデータが東京工業大学の支援チームへ送られ、現在新たなドラフト・ゲノム再構築とEゲノム推定並びにID領域の検出が進行中である。

Strategy for Future Research Activity

前年度末３月に、東京工業大学の先進ゲノム支援チームから、PacBioのLong-readデータによる新たなドラフト・ゲノム構築の新規アセンブリの工程に想像以上に時間を要しているが、リシーケンス・データとしては、Iluminaのshort-readデータ２個体に加え、初年度に受託解析で得た１個体分の３個体分について解析の準備は整っている旨の連絡をもらっている。
今年度は、このS並びにGゲノムにおけるドラフト・ゲノムの再構築から得られる推定Eゲノム並びにID領域の検出と、リシーケンス・データトの比較解析から得られるID領域の個体差の有無についての支援チームの解析結果を受けて、現在までに解析に着手したID領域の検証を行いつつ、新たに検出されるであろうID領域と並行して詳細なFISH解析を行う。このFISH解析により、ID領域が、染色体放出によって体細胞から失われている16本の染色体上に座するものではなく、生殖細胞においては捨てられない36本の染色体上に存在するが、体細胞におけるこの36本の染色体上には座していないことを明らかにする。更に、より詳細な解析により、ID領域が座する染色体は、36本の染色体の内の何本かに限定されているのか、ID領域は広く分散し36本の染色体に散りばめられているのかを検証することにより、ヌタウナギの染色体放出における内部欠失型のゲノム再編成の実態や機序、意義などの解明に繋げていく予定である。

Causes of Carryover

2020年度は新型コロナ・ウイルス蔓延に伴う入構規制等の影響で、研究活動に費やせる時間がほとんど無かったため、研究活動に大幅な遅れが生じた。そのため2020年度の実施予定の研究を2021年度に実施して、当初３年間としていた研究期間を１年間延長して４年間とした。当初3年目で使用する予定であったFISH解析の研究試薬を中心に次年度使用額は使用する予定である。