硬骨魚類メダカの種内変異を利用した季節繁殖停止の制御機構の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06785
• Research Institution: Center for Novel Science Initatives, National Institutes of Natural Sciences
• Principal Investigator: 大竹 愛 (四宮愛) 大学共同利用機関法人自然科学研究機構(新分野創成センター、アストロバイオロジーセンター、生命創成探究, 生命創成探究センター, 特任助教 (60452067)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 光周性 / 季節繁殖 / メダカ / 地理的変異 / 卵巣 / QTL解析 / 次世代シーケンス

Outline of Annual Research Achievements

温帯地域では、生物を取り巻く自然環境は季節に伴って大きく変動するが、生物は季節を感知して行動や生理機能を変化させて環境変化に適応している。生物の季節適応機構の理解は、基礎生物学的観点、また農水産業への応用や臨床医学的観点においても重要である。本研究では、日長の季節変化に対して明瞭な応答を示すメダカをモデルとして、季節繁殖の停止における短日応答の種内変異に着目し、次世代シーケンサーを利用した遺伝学的解析およびトランスクリプトーム解析、遺伝子編集技術を応用した機能解析から、これまで不明であった脊椎動物の繁殖停止における日長感知と繁殖抑制の分子メカニズム解明を目指す。
日本各地に由来するメダカの短日応答のこれまでの解析から、低緯度地域に短日応答性を失った集団が存在すること、また応答型の清須、不応答型の宮崎の集団のF2世代を用いた量的形質遺伝子座 (QTL) 解析から9番染色体上に有意なQTLを明らかにしていた。今年度は詳細マッピングのため、F2個体の全ゲノムシーケンスデータから、QTL周辺の詳細な遺伝地図を明らかにし、また、より近縁である串間、宮崎集団を用いた遺伝解析を進めた。宮崎集団内に短日応答の多型が存在することが示唆されたため、今後は宮崎集団を用いた遺伝解析も行う。さらに各メダカ集団の全ゲノムシーケンスデータを用いてQTL領域内の候補遺伝子のアミノ酸翻訳領域の一塩基多型および挿入/欠失の解析を進めた。候補遺伝子のひとつについて、CRISPR/Cas9システムを用いて候補遺伝子のノックアウトメダカの作成を行った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

現在までに、実験計画1-4を以下のように遂行した。実験1では期待と異なる結果が得られたが、計画を改訂して実行することで今後の解析に用いる実験試料を得ることができた。また実験2-4では問題が生じておらず、概ね順調に進行していると考えられる。
(実験1) 短日応答のQTL解析において、(1) (清須×宮崎) F2、(2) (串間×宮崎) F2 の組み合わせの交配を行い、マッピングを進めた。（1）の交配から明らかにしていた9番染色体のQTL領域について、F2の全ゲノムシーケンスデータを用いて詳細な遺伝地図情報を得た。(2)の交配では、異なる3家系の雌、計158個体の表現型解析を行った結果、宮崎集団内に短日応答の多型があると判断された。そのため当初の予定を変更し、遺伝解析に有効な1家系のみから再度F2世代雌を育成し、134個体の表現型解析を行った。2回の表現型解析の結果から、遺伝解析に用いるF2個体を得ることができた。さらに、宮崎集団内の短日応答の多型を明らかにするため、宮崎集団のみを用いた解析を計画し遂行中である。(実験2) ゲノム配列の系統間比較において、(清須×宮崎) F2のQTL領域内の候補遺伝子のアミノ酸翻訳領域の一塩基多型および挿入/欠失の解析を進行中である。 (実験3) トランスクリプトーム解析と系統間比較に関して、長日条件下の清須、宮崎のRNA-seqについて比較解析を進め、また短日条件の採材準備を進行中である。 (実験4) 候補遺伝子の機能解析では、CRISPR/Cas9システムを用いて候補遺伝子のノックアウトメダカの作成を行った。G0世代の遺伝子型判定により、予定した領域に欠失が生じていることが確認されたので、これらのG0世代を選別した後、系統化し、表現型解析を行う予定である。

Strategy for Future Research Activity

(実験1) 短日応答のQTL解析において、 (串間×宮崎) F2 の表現型解析の結果から、短日不応答型/応答型を示した個体から抽出したゲノムDNAを群内で混合し、次世代シーケンサーによる全ゲノムシーケンス解析を実施する。一塩基多型(SNP)頻度の解析から、群間で差のある領域をQTLとして検出する（QTL-seq)。また、解析に用いた宮崎集団が由来する自然集団を採集し、G0またはG1世代を用いて表現型を解析し、QTL-seq解析を行う。さらに、既にデータを取得済である宮崎と串間を含む九州系統40個体の全ゲノム配列を加えて、短日応答の全ゲノム関連解析(GWAS)を行い、関連するSNPsを同定する。(実験2) 実験1の短日応答の QTL-seq、GWASの結果から候補遺伝子を検討し、アミノ酸翻訳領域の一塩基多型および挿入/欠失の解析を行う。(実験3) 実験1で既に採材を行った不応答型/応答型のF2個体について、脳視床下部・下垂体領域からRNAを抽出しトランスクリプトーム解析(RNA-seq)を行う。また不応答型の宮崎と応答型の清須について、長日、短日暴露個体のRNA-seqから、短日暴露によって発現量が変動する遺伝子を系統間で比較し、違いを検出する。採材にあたっては、実験1から得られるSNPマーカーを利用して、宮崎集団から短日不応答型の個体を選抜する予定である。 (実験4) CRISPR/Cas9システムを用いて候補遺伝子のノックアウトメダカの作成を行い系統化する。繁殖期における短日応答性を調べ、繁殖停止に関連する遺伝子の発現動態をノックアウト個体と野生型で解析し比較する。

Causes of Carryover

2019年度に (宮崎×串間) F2を試料として、次世代シーケンス受託解析を予定していた。しかし、F2の表現型解析の結果から特定の家系を用いることが必要であることが判明したため、家系を選抜してF2世代を再度準備し表現型解析を実施した。そのため予定していた受託解析の執行を年度内に行うことができず、次年度へ繰り越すこととなった。解析個体が準備されたので、2020年度にはそれらの試料からDNAおよびRNAを調整し、ゲノムシーケンス、RNA-seqの受託解析を実施予定であり、これらを主要な経費として予定している。
また、それらの次世代シーケンスの結果から得たQTLs領域に存在する候補遺伝子について、塩基多型解析および発現解析により候補遺伝子を絞り込む。各候補遺伝子について、交配に用いた親系統におけるアミノ酸配列の変異を明らかにする。それらの解析に用いる分子生物学関連試薬、実験器具、実験動物(メダカ)飼育費等の消耗品費、また実験動物の飼育管理と実験補助の人件費、研究成果発表、研究情報収集のための国内旅費を執行予定である。