横断的クロスリンクプロテオミクスによるシナプスタンパク複合体の進化的起源の解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06796
• Research Institution: Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University
• Principal Investigator: 早川 英介 沖縄科学技術大学院大学, 進化神経生物学ユニット, 研究員 (20739809)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 渡邉 寛 沖縄科学技術大学院大学, 進化神経生物学ユニット, 准教授 (80356261)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: プロテオミクス / 進化生物学 / シナプス

Outline of Annual Research Achievements

本年度は主に原始的な生物のシナプスタンパク複合体の分析系の構築を進めた。
まず、各種クロスリンカーを比較およびクロスリンク効率の検証を行うことで、より正確なタンパク複合体の検出を可能にした。本実験で得られた原始的な生物におけるクロスリンカーの効果と各種実験条件は本研究のみならず、それぞれの生物種における、質量分析ベースでのタンパク複合体研究に応用することが可能である。
また、先行のプロテインコリレーションプロファイリングでは主に古典的なData Dependent Acquisition(DDA)によるペプチド同定および定量が行われていたが、DDAで得られる定性・定量データは感度と再現性に関して問題がある。本研究ではペプチドの同定と定量を高感度で高い再現性で行うことが重要であると考え、Data Independent Acquisition(DIA)での分析の検証と最適化を行った。本研究で初めて構築される原始的な生物のペプチドスペクトルライブラリは本研究だけではなく、他の原始的な動物のプロテオミクス研究にも広範囲で活用することが可能である。
シナプスタンパクは他の構造タンパクよりも微量なことから、高感度での網羅的な分析法の確立が必要不可欠である。本年度で構築した分析は高感度と高い再現性を両立したものであり、これまで難しかったシナプスタンパク複合体の大規模で網羅的な分析が可能になることが期待できる。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

クロスリンカー及びクロスリンク条件の検討：原始的な生物におけるクロスリンクプロテオミクスを可能にするために、クロスリンカーの種類及び反応条件の検討を行うことで、最適な反応条件の設定を行った。

LC-MSの最適化:質量分析によるプロテインコリレーションプロファイリングを高感度で行うためのスペクトルライブラリを生物由来のプロテオーム情報およびLC-MSデータから生成し、Data Independent Acquisitionで高感度・高い再現性の分析を可能にした。

Strategy for Future Research Activity

今後はこれまでに構築された分析条件を利用し、実際に各種の生物を組織的に分析する。
クロスリンクプロテオミクスとプロテインコリレーションプロファイリングを各動物に同時に行うことで相補的な複合体情報を取得する。試料が微量であったり、目的タンパクが十分な感度で検出されない場合は、抗体を使った目的タンパクの濃縮なども試みる。
その後、得られた質量分析データを網羅的に解析して、プロテインコリレーションプロファイリングのデータからは複合体の構成タンパクを、クロスリンクプロテオミクスデータからはより詳細なタンパク複合体の構造情報解析を試みる。

Causes of Carryover

試料調整関連の消耗品および小型器具に関しては他の外部資金で取得したものに代用が可能であったため、使用額が予定よりも下回った。
次年度ではよりハイスループットな試料調整が必要となるため、次年度使用額を用いて専用の小型試料調整補助装置を購入予定である。