2021 Fiscal Year Research-status Report
横断的クロスリンクプロテオミクスによるシナプスタンパク複合体の進化的起源の解明
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19K06796
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| Research Institution | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University |
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Principal Investigator |
早川 英介 沖縄科学技術大学院大学, 進化神経生物学ユニット, グループリーダー (20739809)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
渡邉 寛 沖縄科学技術大学院大学, 進化神経生物学ユニット, 准教授 (80356261)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | タンパク / タンパク複合体 / プロテオミクス / 質量分析 / 進化生物学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は昨年度までに構築したタンパク複合体の分析系を用いて実際の動物由来のタンパク複合体の網羅分析を開始した。本年度は研究室で飼育・繁殖し試料の入手が容易な刺胞動物のNematostella vectensisを試料として用い、昨年度までで最適化したクロスリンク条件によりN. vectensis組織を処理したうえで破砕することでcytosolic, membrane両画分のタンパク質複合体の抽出を行った。抽出したタンパク複合体群に関して、サイズエクスクルージョンクロマトグラフィー（SEC）による分離およびトリプシン処理を行いLC-MS/MS用の試料を作成した。
トリプシン処理により断片化された各フラクションのタンパク複合体由来のペプチドに関して、LC-Orbitrapによるhigh resolution MS1およびMS2（フラグメントスペクトル）を網羅的に取得した。
取得したLC-MSデータに関して、各ペプチドの比較定量データをSEC時間軸での変動量として定量化した後、溶出ピークの検出及びピーク形状の定性を行った。このSEC溶出データは各タンパクのSEC上での挙動を示し、同じ複合体を形成するタンパクは同様のピークを形成すると考えられる。
これらの分析データを解析し、検出されたペプチドに基づくタンパクのアノテーションとSEC溶出情報を統合するプログラムを独自に開発し、SECで挙動を共にするタンパク群の網羅的な同定を行った。
本研究により原始的な生物（刺胞動物）の網羅的タンパク複合体情報を解析するための膨大な分析データの取得およびデータ解析ワークフローが構築された。今後はデータ解析、特に神経系関連のタンパク複合体解析をを進めることで原始的な神経系におけるタンパク複合体の成り立ちが明らかになると期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度までで網羅的なタンパク複合体の分析及びデータ解析の手法・環境が整備され、実際に刺胞動物（N. vectensis）の分析及びデータ解析が行われた。一方で当初予定されていた有節動物（Bolinopsis mikado）に関して飼育・維持の問題点から十分な量の試料を本年度に入手することが出来ず、分析が実施できていない。すでに問題は解決され、来年度からは安定的に実験が可能になる。次年度ではB. mikadoにフォーカスして試料調整及び分析を実施し、有節動物でのタンパク複合体の解析及び刺胞動物との比較解析を実施する予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、昨年度実施できなかった有節動物（Bolinopsis mikado）でのタンパク複合体分析を重点的に行う。すでに刺胞動物（N, vectensis）で実施したクロスリンク法の調整を行った後、同様の条件でLC-MS/MS分析およびデータ解析を行う。
また、本手法によるタンパク複合体同定の再現性の検証も行う。Technical replicateを用いた分析・データ解析を行い、解析結果の再現性の検証および複合体判別のためのピーク形状の相関性に関するパラメータの検証も行う。この際、複合体を形成しないことが分かっているタンパクの組み合わせを利用するなどしてFalse discovery rateの活用も検討する。
上記の分析・データ解析と検証を行ったうえで刺胞動物・有節動物のタンパク複合体、とくに神経関連複合体を明らかにし、すべての複合体及び構成タンパクのリストをネットワーク形式のデータセットとして公開を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
当初本年度行う予定であった実験に遅れが生じたため、その分の実験用消耗品などを次年度に繰り越すこととした。
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