陸棲ラン藻Nostoc communeの細胞外マトリクスタンパク質の機能解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06828
• Research Institution: Kanazawa Institute of Technology
• Principal Investigator: 坂本 香織 金沢工業大学, 基礎教育部, 准教授 (10367443)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: Nostoc commune / 細胞外マトリクス / 抗酸化酵素 / 抗酸化タンパク質 / WspA

Outline of Annual Research Achievements

大腸菌Escherichia coliで発現させる陸棲シアノバクテリアNostoc communeの細胞外マトリクスタンパク質をコードするDNAのうち、遺伝子型A株 (KU002)のDpsタンパク質（Npun_R3258ホモログとNpun_R5799ホモログ）を合成させる発現コンストラクトを完成させた。
これまでにクローニングを完了させていたNpun_R3258ホモログ（部分長）とNpun_R5799ホモログ（完全長）のDNAを鋳型として、発現ベクターpET-26b(+)に組み込むために両端に制限酵素認識部位を付加したプライマーを設計し、両遺伝子のDNAを増幅した。pET-26b(+)は発現産物の菌体内からペリプラズムへの分泌を可能にするpelBリーダーペプチドをコードするDNA領域を有しているため、それぞれのホモログについてリーダーペプチドの付加の有無により産物を発現させるコンストラクトを作製した。現在は作製したコンストラクト計4種類の塩基配列のシーケンシングによる確認を終え、これから発現用大腸菌BL21 DE3株への形質転換と発現誘導条件と局在の検討を行い、発現産物のカルボキシル末端に付与されたHisタグにより産物を精製する。精製タンパク質を用いて、多量体化、鉄結合能およびフェロキシダーゼ活性、DNA結合能、活性酸素種(ROS)消去能を調査する。
併せて、既にクローニングを終えているスーパーオキシドディスムターゼ (SOD)、カタラーゼ、および水ストレスタンパク質(WspA）についても、遺伝子型A株 (KU002)のDNAを用いて発現コンストラクトの作製に取り掛かる予定である。
一方、本研究課題で重要となるN. communeの形質転換系に関してはこれまでに、N. communeの数珠細胞を単細胞化する条件検討、および抗生物質耐性プラスミドによる予備的な実験を終えており、今後は蛍光タンパク質遺伝子を導入して形質転換効率を高める条件を検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

まず、年間を通して授業を実施する学期中は、担当科目での指導経験がまだ少なかったため、授業の準備と課外の学生面談にかなりの時間を要し、一定量以上の時間を確保して実験を実施することが極めて困難な状況であった。
次に、当該年度に入った6月に実験室の移転を余儀なくされ、それに伴う物品の移動と整理、実験室の再構築・規模縮小等の作業に前後1ヶ月程度ずつを要し、この間は実験の実施が不可能であった。
さらに、実験実施者が6月に左鎖骨を、そして11月には右手首を骨折し、実験が再開できるまでに回復するのに前者は1ヶ月程度、後者では3ヶ月以上を要した。
技術的な面では、遺伝子をコードするDNAの発現ベクターへのクローニングを当初は1ステップで行う予定であったが、それができずに結果的に汎用ベクターを介した2ステップに変更せざるを得なかったことで時間を要した。加えて、一部の外部委託プライマーに塩基配列エラー含まれていたことが、クローニング完了後の塩基配列の確認の段階で判明し、クローニングを一から再実施せざるを得なかったことも、先に進めなかった大きな要因である。

Strategy for Future Research Activity

シアノバクテリアではこれまでに多くの抗酸化酵素・タンパク質の研究報告がされてきたが、そのほとんどが細胞内で単独で機能するタンパク質である。陸棲シアノバクテリアN. communeがそれらの分子と同等の機能をもつタンパク質を細胞外マトリクスに集約させることにより自らの細胞を保護することは予想されていたが、それを科学的に証明することで今後の研究として2つの方向性が生じると考えられる。
1つはN. communeの細胞外マトリクスにおける抗酸化分子の相互作用や相対的役割分担の程度を知ることで細胞外マトリクスの役割をより包括的に理解するための研究であり、もう1つはN. communeにおけるタンパク質分泌機構の研究である。前者は真核細胞における細胞小器官の機能とその調節に倣う形に発展する可能性を秘めており、後者では細菌種の違いによりタンパク質分泌装置に様々な型が存在するが、シアノバクテリアにおけるタンパク質分泌研究はあまり進んでいない。したがってN.communeの培養細胞を用いて細胞外マトリクスタンパク質の分泌機構を解析することにより、シアノバクテリアにおけるタンパク質分泌に新たな局面が見出される可能性がある。

Causes of Carryover

設備備品として申請したエレクトロポレーターの機種（Twin-Wave エレクトロポレーターGemini X2・BTX）は、当該年度に受領した研究費の額では購入できなかったため、機種をGene Pulser Xcell 微生物エレクトロポレーションシステム (Bio-Rad)に変更した。併せて購入時期が当該年度末であったことにより、キャンペーン価格での購入となり、支出額が更に減じられた。
これらの使用額は、今後E. coliで発現させるN. communeの細胞外マトリクスタンパク質の種類の増加に伴うクローニングや発現産物の精製、そして精製産物を用いた様々な解析に必要となる試薬の購入に使用する予定である。