2020 Fiscal Year Research-status Report
Reconstitution of synaptic plasticity in vitro
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19K06885
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
細川 智永 名古屋大学, 理学研究科, 講師 (30602883)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 液液相分離 / シナプス可塑性 / 長期増強 / 記憶 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
シナプスの可塑性とは学習や刺激に応じてシナプスの情報伝達効率が可塑的に増強（LTP）もしくは抑圧（LTP）されることである。このことはシナプス膜に存在する伝達物質受容体等の蛋白質の増減、機能修飾または局在の調節によって実現していると考えられてきた。この調節機構のカギはシナプス後膜肥厚（PSD）が握っている。また、近年の超高解像顕微鏡の発達により蛋白質の集合体の中にさらに特定の蛋白質が集合したナノドメインが存在し、情報伝達効率の調節を行っていることが分かってきた。しかしながら、PSDやナノドメインの形成機構、PSDの持つ環境応答性、可塑性、恒常性等の記憶形成に必要な性質を担保する機構は不明だった。細胞内の蛋白質や核酸の振る舞いを集団として理解しようとする相分離生物学は、これまでに説明できなかった細胞内分子の挙動を説明し、未解明の生命現象を次々と明らかにしている。これまでの先行研究によりPSD蛋白質が液－液相分離により相分離集合体を形成することが分かってきた。そこで本研究では精製蛋白質を混合し学習を模倣した刺激を与えることで試験管内にシナプス可塑性を再現する。
CaMKIIとNMDA受容体の精製蛋白質溶液を混合し、カルシウムイオンを加えたところ、液－液相分離による相分離集合体が形成された。興味深いことに、CaMKIIの自己リン酸化による立体構造の可塑的な変化により、カルシウムを取り除いても相分離は維持される。このことは相分離集合体に可塑性があることを意味する。さらにAMPA受容体-PSD-95の存在下では相内相の形成により三相構造を形成することが分かってきた。この三相構造はナノドメインの形成機構と考えられた。以上の結果はNature Neuroscienceに掲載された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
CaMKIIとNMDA受容体の精製蛋白質溶液を混合し、カルモデュリンおよびカルシウムイオンを加えたところ、液－液相分離による相分離集合体が形成された。この相分離集合体が液体としての性質を持つことは蛍光褪色法および融合イベントの観察によって確かめた。この相分離集合体はカルシウムイオンを取り除くと離散したが、ＡＴＰの存在下では興味深いことに、CaMKIIの自己リン酸化による立体構造の可塑的な変化により、カルシウムを取り除いても相分離は維持された。このことは相分離集合体に可塑性があることを意味する。AMPA受容体-PSD-95は刺激に依存せず混合するだけで相分離集合体を形成することが分かっている。そこでこれらの存在下でCaMKIIの液－液相分離を誘導したところ、相内相の形成により三相構造の形成が観察された。これはPSDに実際に見られるナノドメインと酷似している。重要なことに、ナノドメインとはこれまで思われていたような単に蛋白質が集合しているのではなく、お互いが区画化しているのである。そこで超高解像顕微鏡によりナノドメインを観察したところ、in vitroの結果と同様にNMDA受容体とAMPA受容体の区画化されたナノドメインが確認された。さらに相分離を阻害するペプチドを導入したところ、区画化が崩れていることが分かった。これらの結果は、シナプス可塑性をin vitroで再現して得られた知見が実際のシナプスに適用されることを示している。これらの結果はNature Neuroscienceに掲載された。
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| Strategy for Future Research Activity |
ナノドメインの形成機構が分かったことは、シナプス可塑性ひいては記憶形成の分子機構の本質が分かってきたことを意味する。超高解像顕微鏡による観察ではチャンネル数の制限から単に特定の蛋白質が集合したものと捉えられてきたが、これは異なる成分を持つ相分離集合体の区画化であると表現できる。すなわち、お互いが引き寄せ合いまたは反発し合うことで形成されていると言える。そう考えるとＰＳＤのすべての蛋白質がこのような区画化の影響を受けうることが分かる。すなわち、参加するのか、排斥されるのかという影響である。このことはシナプスにおける蛋白質量の管理、特に核で発現した蛋白質が記憶刺激を受けたシナプスに移行する際に重要な問題である。そこで本研究では近位依存性ラベリング手法を用いてCaMKIIとNMDA受容体側に参加する成分とPSD-95-AMPA受容体側に参加する成分を同定していく。また、これまでの研究では水溶液中に形成される三次元の構造体を観察してきたが実際のシナプスでは膜蛋白質が初めに集合すると考えられ、二次元構造から厚みのある三次元構造への遷移が起こっている。このことはシナプスの形成にも重要な役割を果たしていると考えられ、記憶や学習のみならず発達や疾患の機序を明らかにするためにも重要な課題である。そこでこれを再現するために、人工脂質二重膜のシステムを用いてシナプス可塑性をin vitroで再現していく。
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| Causes of Carryover |
COVID-19の影響で使途に遅れが出たが、研究計画に変更はない。
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Research Products
(9 results)
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[Journal Article] Arc self‐association and formation of virus‐like capsids are mediated by an N‐terminal helical coil motif2020
Author(s)
Eriksen MS, Nikolaienko O, Hallin EI, Grodem S, Bustad HJ, Flydal MI, Merski I, Hosokawa T, Lascu D, Akerkar S, Cuellar J, Chambers JJ, O'Connell R, Muruganandam G, Loris R, Touma C, Kanhema T, Hayashi Y, Stratton MM, Valpuesta JM, Kursula P, Martinez A, Bramham CR.
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Journal Title
The FEBS Journal
Volume: 288
Pages: 2930～2955
DOI
Peer Reviewed / Int'l Joint Research
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