2020 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism and physiological significance of translational readthrough in higher animals nervous system
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19K06889
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| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
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Principal Investigator |
山口 宜秀 東京薬科大学, 薬学部, 准教授 (50311832)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 翻訳リードスルー / ミエリン / 細胞接着 / リン酸化 / PKC / シャルコー・マリー・トゥース病 / 脳・神経 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、L-MPZを中心にその生理機能や産生メカニズムを明らかにし、高等動物神経系における生理的な翻訳リードスルー機構の存在意義を解明することを目的としている。そのために研究期間内に１）L-MPZとP0の比率を変化させたマウスの解析、２）L-MPZ特異的なPKCリン酸化サイトの機能解析、３）L-MPZ産生制御メカニズムの解析を行う予定である。L-MPZは、末梢ミエリン主要タンパク質P0 mRNA翻訳の際に、最初の終止コドンがリードスルーされ次の終止コドンまで進み、C末部に追加ドメインが付加した構造を持つアイソフォームである。これまでにゲノム編集によりP0の代わりにL-MPZのみを産生するマウス (L-MPZマウス) を作製した。成体L-MPZマウスの解析では、L-MPZタンパク質の過剰な増加により末梢有髄神経に異常を引き起こし、運動機能障害を示すことから、このマウスが神経難病であるシャルコー・マリー・トゥース病の新たなモデル動物となることを明らかにしてきた（Commun Biol. 2020年、大谷ら）。本年度はこのL-MPZマウスのミエリンの形成・維持過程における解析をさらに進め、ミエリンやランビエ絞輪周辺部の異常の他に、ミエリン最外層の細胞質含有部分の構造異常や浸潤するマクロファージタイプの変化などが明らかとなった。またこれらの異常の度合はL-MPZの増加量や加齢に影響を受けることが明らかとなった。さらにL-MPZを産生できずP0のみを産生するP0マウスでは、見かけ上の運動機能障害は認められなかったが、神経刺激による複合筋活動電位の振幅の高さが減少し、それと関連して免疫蛍光染色法によりランビエ絞輪周辺部の異常などが認められた。これらは日本神経化学会大会にて発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はコロナ禍の影響もあり、思うように実験を行うことができず遅れた部分もあるが、L-MPZ産生の異常に増加したL-MPZマウスとL-MPZを産生できないP0マウスの比較により、適正な量のL-MPZ産生が正常なミエリン形成に重要であることが明らかとなってきている。また計画２）のL-MPZの予想機能ドメインであるPKCリン酸化部位の変異マウスの委託作製や培養細胞強制発現系による細胞接着による機能解析の準備なども進んだため、進捗状況としてはおおむね順調に進展していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は、計画２）を中心に強制発現細胞接着系を用いて、細胞接着性とPKCによりリン酸化されるLMPZ特異的ドメインとの相関を明らかにする。LMPZ特異的ドメインのPKCリン酸化を検出するためのペプチド抗体を作製したので、その抗体の有用性の確認と共に生体内に存在するリン酸化LMPZの解析を試みる。またさらに生体内での影響を調べるために、ゲノム編集マウス作製委託により得られたLMPZ特異的ドメイン内のPKCリン酸化部位を変異させたマウスのファウンダー（F0）マウスをもとに系統化を行い、系統確立後に運動機能や形態学的変化を解析する予定である。並行して計画3）としてL-MPZの産生制御に関わる分子の探索も進めたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
抗リン酸化抗体作製に時間を要し納品が遅れ年度をまたいだため、抗体作製費用として次年度使用額が生じた。次年度請求分は、主にマウスの系統化とそれらを用いた生化学・組織学的解析、培養細胞系を用いた解析のために用いる予定である。
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