2021 Fiscal Year Research-status Report
ペリニューロナルネットによる機能的なシナプス伝達モジュレーションの解明
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19K06890
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
廣野 守俊 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (30318836)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | コンドロイチン硫酸プロテオグリカン / 小脳核 / GABA / 自発運動 / 慢性拘束ストレス / 痛覚過敏 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
記憶痕跡の解明は、単に記憶学習の形成と維持の機構を明らかにするだけではなく、外部環境への適応方法の理解や、精神疾患やその他脳機能障害の原因究明にもつながると考えられる。ペリニューロナルネット（perineuronal net, PNN）は中枢神経系における細胞外マトリックスであり、一生涯続くような記憶の維持にかかわる構造物である。PNNはシナプス結合部位を包み込んで形態的に安定化し、そこでのシナプス伝達を長期にわたって一定に保つことに寄与すると考えられている。我々の先行研究では、PNNが神経終末からの神経伝達物質放出を機能的にモジュレーションする可能性が示唆された。本研究の目的は、その機能的モジュレーションの分子機構を明らかにすること、また、PNN形成を制御する環境因子や外部刺激を明らかにすることである。これまで、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（CSPG）の糖鎖であるグリコサミノグリカン（GAG）の小脳核ニューロンにおける抑制性シナプス後電流（IPSC）に対する作用を調べてきた。
動物実験では、目的の脳部位からPNNを除去するために、CSPG糖鎖の分解酵素であるchondroitinase ABC (ChABC)のインジェクションが用いられてきた。しかし、この方法は侵襲的であり、非選択的にGAGを分解するためChABCの臨床応用は困難である。そこで非侵襲な方法として、PNNの密度低下を惹起するであろう自発運動をマウスに行わせた。またその反対の効果として、慢性拘束ストレスを負荷したマウスを作製した。このストレスマウスは痛覚過敏を示すこと、その痛覚過敏は自発運動で緩和されることを確認した。ストレスや自発運動によるPNNの密度変化を現在解析中である。さらに機能性食品の摂餌や匂いがPNNの密度に如何に影響を与えるか検証中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
GAGがシナプス伝達を機能的にモジュレーションすることによって、記憶・学習を如何に制御するかについてはほとんど分かっていない。我々の先行研究では、GAG除去が抑制性シナプス伝達を増強し、マウス瞬目反射条件づけの学習効率を上昇させることを明らかにした。これまでは、PNN構築前の幼若マウスから小脳切片を作製し、小脳核ニューロンへホールセル電位固定法を適用してIPSCを記録し、GAG灌流投与の効果を調べた。CS-6Sは誘発性IPSCの振幅を小さくしたものの、paired-pulse ratioを変化しなかった。一方CS-4Sは、誘発性IPSCの振幅を小さくしたものの、paired-pulse ratioを上昇させた。しかし、これら硫酸化パターンの影響を統一的に解釈するに至っていない。また、PNNがプレシナプスのGABAB受容体の局在を制御する可能性を検証している。GABAB受容体アゴニストであるバクロフェンによるIPSC抑制を記録し、用量反応曲線を作成している。さらにChABCで処理した小脳切片を用いてその曲線を調べている。
PNNの密度を低下させる非侵襲な方法として、マウスに自発運動させるvoluntary wheel runningを導入した。その対極として慢性拘束ストレスマウスを作製した。ストレス性痛覚過敏を確認し、自発運動で緩和されることを明らかにした。PNNの密度を今後解析する予定である。また、ある機能性食品を混餌投与したり、その匂いを嗅がせたりすることで、痛覚過敏が緩和される可能性を見いだした。この機能性食品のPNNへの影響に興味が持たれる。
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| Strategy for Future Research Activity |
小脳核の抑制性シナプスにおいてCSのターゲット分子を明らかにするため、受容体型チロシンホスファターゼのシグナル伝達阻害剤を各種用いる。また、分解酵素のChABCでGAGを除去した成獣の小脳切片も使用する。可能であれば、HSの抑制性シナプス伝達への寄与も解明する。
小脳核ニューロンにおける興奮性シナプス伝達がPNNによって如何に制御されているか検証が進んでいない。今後まずは、小脳核ニューロンへの２つの興奮性シナプス入力である登上線維と苔状線維を電気刺激して興奮性シナプス後電流（EPSC）を安定して記録できるようにする。そして、小脳核ニューロンからPNNを除去して、その影響を明らかにする。GAG除去による興奮性シナプス伝達への作用を明らかにすることは、小脳運動学習へのPNNの重要性をさらに確かなものにするものと考えられる。PNNがプレシナプスのGABAB受容体の局在を制御するか否かを検証するため、バクロフェンによるIPSC抑制の用量反応曲線を求め、PNN有無での相違を明らかにする
自発運動をさせたマウスと慢性拘束ストレスを負荷したマウスの小脳核でのPNNの密度をWisteria floribunda agglutinin (WFA)染色により定量化、比較検討する。ストレス性痛覚過敏を緩和する可能性のある機能性食品を見出した。そこでこの食品を混餌投与したり、あるいはその匂いを嗅がせたりすることで、小脳核、あるいは下行性疼痛調節系にかかわる延髄においてPNNの密度に変化があるか否か検証を行う。
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| Causes of Carryover |
新型コロナの影響により学会参加の旅費が支出されなかったため。次年度使用する試薬の物品費として、また論文の掲載費として使用する予定である
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