2022 Fiscal Year Research-status Report
アストロサイトの微細プロセス別に異なるドーパミン受容体サブタイプが発現する可能性
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19K06898
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
長友 克広 弘前大学, 医学研究科, 助教 (30542568)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | ドーパミン受容体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、これまでに報酬や運動制御に重要とされるドーパミンの受容体分布を成熟マウスの線条体、黒質網様部、皮質視覚野から急性単離したアストロサイトについて調べたところ、D1ドーパミン受容体(D1R)は黒質網様部と線条体で非常に高発現しており、皮質視覚野ではほとんど発現せず、さらに線条体ではD1Rを高発現する群とほとんど発現しない群に二分されることを報告した(Nagatomo et al, Front Neuroanat. 2017)。その後の研究により、線条体アストロサイトでは、細胞内シグナルが正反対のD2ドーパミン受容体(D2R)を単一細胞に発現している可能性が出てきたことから、本研究では、DRを発現する細胞が蛍光標識される遺伝子組換え(TG)マウス2系統を利用し、同一細胞に異なる受容体を発現する可能性およびその生理機能を検証することを目的としている。D2Rについては、すでに線条体アストロサイトにおける発現に関する報告があり、vglut1陽性アストロサイトではD2Rとアデノシン受容体が共発現しておりパーキンソン病への関与が示唆される(Cervetto et al, J Mol Neurosci, 2018)。現在までに同一個体の同一脳スライスからポジコン、ネガコン、評価サンプルを採取できるような脳スライス作製を検討し研究を進めているが、アストロサイトマーカーであるGFAPで脳スライスを染色したところ、GFAP陽性アストロサイトは神経核特異的に多様な疎密分布を示した。特に解析対象としている線条体では非常に疎な状態を示し、急性単離して分散した脳細胞からGFAP陽性アストロサイトを探すことが困難である(あった)ことを明示していた。そこで他のアストロサイトマーカーを検討した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初使用していたDAKO社のGFAP抗体の信頼性は非常に高いことは使用している研究者が非常に多いことからも明白と考えられるが、矢状断マウス脳スライスのGFAP抗体を用いたDAB染色の結果は、線条体がほぼ白で抜けるという想像していた像からかけ離れていたため、別のベンダーであるニットーボーメディカル(旧フロンティア研究所)のGFAP抗体で検証した。しかし、大差なく線条体が白く抜けるという結果を示した。また、別のアストロサイトマーカーとして、3-phosphoglycerate dehydrogenase(3-PGDH)抗体(ニットーボーメディカル)で確認したところ、GFAP抗体の結果ほどではないが、線条体ではやはり他の神経核よりもDABで染まる細胞は少なかった。本研究課題におけるアストロサイトは、GFAP陽性アストロサイトで見出した異なるドーパミン受容体サブタイプの共発現であり、GFAP陽性アストロサイトの生理機能解析を目指している。現状、非常に稀な細胞を生理機能解析の対象にすることは難しいので「GFAP陽性」というカテゴリーを外して、別種ドーパミン受容体の共発現が見出せるのか検証することも1つの解決策と考えられる。生理実験に関しては、黒質網様部アストロサイトで投与系などを検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
全てのアストロサイトを高率で認識する抗体はおそらく無いはずなので、①3-PGDH抗体を異なるドーパミン受容体発現の検証用として用いることと、②アストロサイト特異的に取り込まれるsulforhodamine 101(SR-101)を急性単離細胞の免疫染色でも利用できるか検討する。予めマウスに腹腔投与し、急性単離を行ってもSR-101の赤色蛍光は確認できるため、単離後、免疫染色過程で色抜けするかどうかの確認となる。また、急性単離後のアストロサイトのプロセスは、大部分がブロッコリー様形態をしており、プロセス1本1本の区別は容易ではない。そこで、極細ガラス管で引っ張る方法の他に、急性単離した後、オーバーナイトで培養し、カバーガラス面へのアストロサイトプロセスの伸長を利用して薬理実験に供する方法を検討する。この方法であれば、ガラス管による接触によるダメージなどを回避し、より簡便に生理実験を実施できる可能性が高い。
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| Causes of Carryover |
実験が難航しており実験方法の再検討が必要になったため、次年度使用額が生じた。再度延長申請を行ったので、実験計画に支障のないように使用する。
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