2021 Fiscal Year Research-status Report
介在神経が前駆細胞から移動能を有した成熟細胞へと分化する機序の解明
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19K06909
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| Research Institution | Wakayama Medical University |
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Principal Investigator |
片山 圭一 和歌山県立医科大学, 医学部, 准教授 (20391914)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Rhoファミリー低分子量Gタンパク質 / 介在神経 / 細胞移動 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Rhoファミリー低分子量Gタンパク質（RhoA, Cdc42, Rac1）を、介在神経の発生母地である内側基底核原基の脳室帯の前駆細胞から欠損させると介在神経の移動が障害されるが、移動中の介在神経で欠損させても移動は障害されない。これは介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟介在神経へと分化するのに必須のイベントが内側基底核原基の脳室帯に存在し、そのイベントにはRhoファミリー低分子量Gタンパク質が必須であることを示している。本研究はその分子メカニズムを解明することを目的としている。
先ず、Rac1とCdc42のノックアウトマウスを用いて、内側基底核原基の脳室帯のRNA発現解析を行い、Rac1とCdc42の下流で介在神経の移動能獲得に寄与する可能性の高い遺伝子として、Mid1とRgccをそれぞれ同定した。実際に、Mid1とRgccの発現はRac1とCdc42のノックアウトマウスでそれぞれ減少していることを、real-time PCRとin situ hybridization法を用いて確認しており、これら遺伝子が介在神経の移動能を獲得する過程に関与する可能性は非常に高いものと考えられる。
次に、ゲノム編集技術を用いてMid1とRgccのノックアウトマウスを作製した。ゲノム編集で作製した遺伝子改変マウスは、ガイドRNAが標的とする配列以外のゲノム領域に、意図しない変異が導入される問題（オフターゲット効果）があるため、その影響を減らすために野生型のマウスと6回の交配を行った。現在は、これらノックアウトマウスと介在神経で蛍光色素を発現するレポーターマウスとの交配を行っている。ノックアウトとレポーターのアレルを有するマウスが得られ次第、介在神経の移動に関する詳細な解析を行う。この実験により、介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟介在神経へと分化する機構を解明することができるものと期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
現在までにRac1とCdc42のノックアウトマウスの内側基底核原基の脳室帯から抽出したRNAを用いてRNA-Seq解析を行い、どちらのノックアウトマウスでも成熟した介在神経に発現する遺伝子の発現が増加していることを明らかにした。この結果は、遺伝子発現の観点からは前駆細胞から成熟介在神経への分化が亢進していることを示しており、一見すると介在神経がほとんど移動することができないという表現型とは矛盾する結果ではあるが、介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟介在神経へと分化する機構を解明する上で重要な知見であると考えている。さらに、Rac1とCdc42のノックアウトマウスの内側基底核原基の脳室帯で特異的に発現が減少する遺伝子として、Mid1とRgccをそれぞれ同定した。これら遺伝子はRac1とCdc42の下流で介在神経が移動能を有した成熟介在神経へと分化する過程に関与している可能性が高いと考えられることから、ゲノム編集技術を用いてこれら遺伝子のノックアウトマウスを作製し、さらに、オフターゲット効果の影響を減らすために野生型のマウスとの交配を行った。交配を行う過程で、流産、育児放棄、授乳中の母マウスの死亡などのトラブルが多数発生し、時間をかなり浪費してしまったが、どちらのマウスも6回目の交配まで終えることができた。今後、これらノックアウトマウスの表現型を解析して各々の遺伝子の機能を明らかにすることで、介在神経の前駆細胞が移動する能力を有する成熟介在神経へと分化する機構を解明することができるものと期待される。
また、Rgccノックアウトマウスは野生型のマウスと比べて、大脳皮質が非薄化していた。Rgccは大脳皮質の神経前駆細胞にも発現しており、介在神経だけではなく、大脳皮質の投射神経の発生にも重要な役割をもっているものと考えられるため、今後はこの点についても解析を加えていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度はMid1とRgccのノックアウトマウスを介在神経で蛍光色素を発現するレポーターマウスと交配して、介在神経の移動の動態や移動中の細胞の形態（成長円錐・突起の長さ・分岐の数等）に関する詳細な解析を行う。今回の解析では、通常の組織学的な解析に加えて、共焦点レーザー顕微鏡のタイムラプス機能を利用して、介在神経の移動の経時的な解析も行いたいと考えている。これらの実験により、RgccやMid1が介在神経の前駆細胞が移動する能力を有した成熟神経細胞へ分化する過程にどのように関与しているかを明らかにする。
さらに、Rac1とCdc42のノックアウトマウスを用いて、移動中の介在神経について、細胞骨格関連タンパク質（F-actin, Cortactin, Ac-Tubulin, Tyr-Tubulin, Tau1等）の細胞内局在に関する解析を行い、脳室帯からRhoファミリー低分子量Gタンパク質を欠損した介在神経に、正常な介在神経と比べてどのような違いがあるのかを解析する。これらの解析により、脳室帯からRhoファミリー低分子量Gタンパク質を欠損することで、介在神経にどのような変化が生じているのかを明らかにし、前駆細胞が移動する能力を有した介在神経へ分化する過程を理解する手がかりにしたいと考えている。また、同様の解析をMid1とRgccのノックアウトマウスを用いて行い、これら遺伝子の欠損が介在神経の分化に与える影響を明らかにする。
また、Rgccのノックアウトマウスでは大脳皮質が非薄化していたため、大脳皮質の神経前駆細胞の増殖・分化に関する解析も行う。妊娠マウスにBrdUを腹腔内投与して、1時間後と24時間後にサンプリングを行い、1時間後では神経前駆細胞中のBrdU陽性細胞の割合を、24時間後では全BrdU陽性細胞の中で神経細胞へと分化した細胞の割合を算出することにより、Rgccの欠損が神経前駆細胞の増殖・分化に与える影響を解明する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由は新型コロナウィルスの感染拡大により、参加予定であった学会が中止になったり、オンライン開催になったりして、旅費を使用する必要がなくなったからである。
研究資金は研究計画の遂行および成果発表に使用させて頂く予定である。
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