2021 Fiscal Year Research-status Report

ザンドホッフ病におけるアストロサイトを標的とした新規治療薬の創出

Research Project

Project/Area Number	19K06914
Research Institution	Meiji Pharmaceutical University
Principal Investigator	小川泰弘明治薬科大学, 薬学部, 講師 (00531948)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2023-03-31
Keywords	活性化アストロサイト / 脳炎症 / リソソーム病 / ザンドホッフ病
Outline of Annual Research Achievements	本研究は、“脳炎症時でのアストロサイトを標的とした中枢神経系作用薬の創出”を目標としている。この目的のために、ザンドホッフ病モデルマウス（Hexb-Knockout［KO］）を脳炎症モデルとして利用し解析を進めている。令和2年度は、薬物によるアストロサイトの活性化抑制やそれに伴う候補分子の発現変化を中心に解析を行った。 Hexb-KOマウスでの脳炎症の原因の一つである炎症性サイトカインにIL-1αとTNFαがあり、これらによって培養アストロサイトを刺激すると、活性化アストロサイトに発現するマーカータンパク質に加え、新規に発現変化するタンパク質も前年度に確認している。IL-1αによるシグナル伝達経路はMyd88-NFκB経路がある。そこで、Myd88-Knockout由来培養アストロサイトを調整しIL-1α及びTNFαを添加することで、アストロサイトの活性化が誘導されるかをRT-PCRで解析したところ、活性化アストロサイトマーカーの発現は減少した。そこで、この経路を可視化しスクリーニングする目的でNF-κBシグナル応答配列にGFPを導入したアデノウイルスを構築した。これにより培養アストロサイトに遺伝子導入を行うことで、サイトカイン刺激によるGFPの発現強度の増強に対してその活性化を抑制しうる候補薬物の添加によるGFPの発現変化を解析した。これらのうち、抗精神病薬でGFPの発現が抑制されることが確認できたが、培養アストロサイトへの添加やHexb-KOマウスへの投与において、毒性が高いことが示された。そこでさらに他の候補薬物を同様に探索した結果、新規に1種類の薬物が得られたが、長期投与により個体への毒性が示された。そこで現在、その他の候補分子の解析を進めている。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason IL-1α／TNFαによって刺激された培養アストロサイト及び15週齢のHexb-KOマウスにおいて発現が誘導される数種の発見された分子群は、Myd88-knockoutマウス由来培養アストロサイトにおいてその発現はサイトカイン刺激において抑制されることを発見した。そこで、NF－κBシグナル伝達経路の活性化を蛍光により可視化し、炎症性サイトカイン刺激に対して蛍光シグナルの増減を指標に候補薬物の解析を行った。その結果抗精神病薬で蛍光シグナルの減少が観察されたが、培養アストロサイト及びHexb-KOマウスにおいて毒性が高いことが判明した。そこでさらに候補分子を抽出し、これは培養アストロサイトにおいても毒性が比較的低いことが確認できた。そこで、この候補分子において、活性化アストロサイトマーカーを一般的な発現マーカーだけでなく神経傷害性（A1）及び神経保護性（A2）の発現抑制ができるかを詳細に解析した。その結果、炎症性サイトカイン刺激を行い活性化した培養アストロサイトにおいて、神経傷害性活性化アストロサイトマーカー（A1）の発現は増強していたが、候補分子を添加したものにおいてその発現が減少していた。続いて、10週齢のサンドホッフ病モデルマウスに3週間継続して投与したところ長期投与により、候補薬物は毒性を示しほとんどの動物が死亡した。そのため、期間を減じることで生存が確認できている2週間の継続投与により、アストロサイトの活性化抑制を検討した。その結果、サンドホッフ病モデルマウスにおいて発現が増加していた神経傷害性活性化アストロサイトマーカー（A1）の発現が一部減少していることが確認できた。しかしながら、大学業務の逼迫により他の候補分子の選定が難航しており、より良い薬物の選定には至っていない。
Strategy for Future Research Activity	[１] 今回、効果が認められた候補分子において、長期投与により毒性がでることが確認された。そのため再度、蛍光による可視化されたNF－κBシグナル伝達経路の活性化を指標に、さらに薬物のスクリーニングを進める。これにより抽出された候補薬物が、炎症性サイトカイン刺激を加えた培養アストロサイトにおいて、活性化アストロサイトマーカーの発現を抑制することが可能か解析する。 [２]2021年度において得られた候補分子の投与法等検討するとともに新規にスクリーニングによって得られた候補分子を用いて、サンドホッフ病モデルマウスに投与し、脳の炎症状態を指標に免疫染色や定量PCR法を用いて検討する。また運動機能解析等行うことで、脳機能の回復を検討する。
Causes of Carryover	次年度に使用が生じた理由として、2021年度において、コロナウイルス感染拡大の長期化に伴い、オンデマンド／ハイブリッド講義などの準備などにより大学業務の比重が拡大したことにより、研究の遂行に著しい影響を受けたためである。次年度に持ち越しした研究予算は、研究の遂行及び論文投稿等に使用する。