2019 Fiscal Year Research-status Report
樹状突起スパインの形成・安定性を担う新たなアクチン骨格制御機構の解明
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19K06931
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| Research Institution | Waseda University |
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Principal Investigator |
榊原 伸一 早稲田大学, 人間科学学術院, 教授 (70337369)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | inka2 / スパイン / 大脳皮質 / アクチン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
正常な脳発達においてニューロンの樹状突起スパインの数や形態のコントロールは神経可塑性の獲得・維持に重要であり、精神発達障害や幾つかの精神疾患ではスパイン密度の変化や異常な形態変化が起きる。Inka2は神経系前駆細胞に強く発現する新規遺伝子であり、細胞内のアクチン骨格再編成を促進し、細胞のフィロポディア形成を促進する働きがあると考えられる。生後のシナプス形成期のニューロンでinka2 mRNA発現は急速に上昇し、成体では海馬や大脳皮質などの前脳領域のニューロンに限局して強いmRNA発現が観察されるが、タンパク質への翻訳は抑制されていることが示唆された。本研究課題ではスパイン形成におけるinka2の役割の分子レベルでの解明を目指す。inka2 KOマウスの大脳皮質をゴルジ染色により組織学的に解析した結果、生後での樹状突起スパインの密度低下、特に成熟型マッシュルーム型スパインが顕著に減少することが明らかになった。さらにInka2 mRNAの翻訳制御に関わる機構を明らかにするため、マウス脳や神経系培養細胞を用いたRNA 免疫沈降（RIP）解析を行ったところ、inka2 mRNAはRNA結合タンパク質Fmr1やTDP43の標的候補の一つであることが示唆された。Fmr1は神経系に発現するRNA結合タンパク質であり、スパイン形成・安定性に異常を示す遺伝性の精神発達障害・自閉症である脆弱X症候群(FXS)の原因遺伝子である。in vitro BrU標識したinka2 RNAを用いて、それに結合するRNP（リボヌクレオタンパク質）を回収するRiboTrap解析を行った結果、Fmr1はinka2 CDS と3’UTRに存在するG4 RNA配列に結合しすること、TDP43はGU塩基に富む配列領域に結合することを明らかとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初の予定通りinka2 mRNAにFmr1 およびTDP43が強く結合することを示した。しかしinka2タンパク質をwestern blotで認識する抗体の作製が遅れており、inka2翻訳制御機構の解明には至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
Inka2のスパイン形成における役割と翻訳調節機構を検討する。胎児期後期から出生後～成体期の各発達時期でinka2 KOマウスの脳を採取しゴルジ染色を行い、大脳皮質V層錐体細胞および海馬錐体細胞を中心に樹状突起スパインの形態、密度をさらに詳細に観察し定量化する。スパインの形態異常・密度減少が発達早期から起きるのか、あるいは成熟後にスパイン変性が亢進するのか調べる。さらにシナプスマーカーやPAK4、CRMP等アクチン骨格関連分子の変化を調べる。またルシフェラーゼcDNAの下流にinka2 mRNA G4 RNA部位を連結したコンストラクトを作成し、fmr1発現ベクターと共に培養細胞に導入する。fmr1発現量に比例しルシフェラーゼの活性の低下、すなわち翻訳抑制が起こるか検討する。
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| Causes of Carryover |
今年度は、inka2 ｍRNAの翻訳調節機構の解析を詳細に行う予定であったが、western blotに使用できるinka2応対の作製が順調に進まなかったため、計画に遅れが生じた。そのため予定した一連の実験の一部が実施できていないため次年度使用額が生じた。これらの費用は計画通り抗体作製と制御メカニズム解明のための実験に使用する予定である。
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