2020 Fiscal Year Research-status Report
3D-Structural Analysis of Diversity in Centrifugal Regulation for Neural Circuit in the Olfactory Bulb by Other Brain Regions
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19K06932
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| Research Institution | Kawasaki Medical School |
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Principal Investigator |
樋田 一徳 川崎医科大学, 医学部, 教授 (40253405)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
清蔭 恵美 川崎医療福祉大学, 医療技術学部, 教授 (30543392)
堀江 沙和 川崎医科大学, 医学部, 助教 (40609666)
佐藤 慧太 川崎医科大学, 医学部, 助教 (80812578)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 嗅球 / 遠心性調節 / セロトニン / アセチルコリン / ノルアドレナリン / ヒスタミン / 多様性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
報告者らはこれまで嗅覚系一次中枢嗅球における嗅覚情報処理機構に注目し、単一ニューロン標識と三次元構造解析を行い、縫線核からのセロトニン 5HTニューロン（Suzuki et al 2015）、対角帯水平脚 HDB からのアセチルコリンAchニューロン（Hamamoto et al 2017）、青斑核からのノルアドレナリン NAニューロン（Horie et al 2021）の嗅球への遠心性投射を明らかにした。当該年度は、これら３種の遠心性投射ニューロンのノルアドレナリン（NA ）ニューロンについて更に解析を進め、層別にvaricosityとシナプスの形態と数が異なるなど、異なる線維による嗅球内での多重分布が分かり、現在、Neurolucidaを用いた形態計測に基づく詳細な定量解析を継続している。この中で、5HT、Ach、NAの３種のニューロンの分布の多様性が著しい顆粒細胞層で、顆粒細胞のGABA免疫反応性に多様性についてレーザー顕微鏡および超高圧電子顕微鏡による詳細な定量解析による結果を論文発表し（Satoh et al 2020）、３種のニューロンの分布とシナプスとの関連性も解析を行っている。
昨年度より解析を始めたヒスタミン（His）ニューロンについては、視床下部乳頭体核（Tuberomammillary nucleus: Tmn）を起始核として、さらに分界条床核に多くのvaricosityを有する細い線維を確認し、嗅球では顆粒細胞層の深部に細い線維が見られた。合成酵素のヒスチジン脱炭酸酵素（histidine decarboxylase: HDC）の免疫染色では顆粒細胞層に最も多く、糸球体層にも僅かにHDC陽性線維が見られた。本年度にはHistamin-Cre mouseを導入を終え、アデノ随伴ウイルスAAVと組み合わせた単一ニューロン標識を行い、解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NAニューロンについては論文発表を行い、掲載雑誌の表紙を飾るなど、高評価を得た。審査を受けている間に、これまで発表を行って来たセロトニン、層別のvaricosityとシナプスの形態と数更に詳細な解析と、シナプス結合の三次元構造と定量解析を進めている。予定より早めに進捗している。
Hisニューロンについては、免疫染色に加えて、嗅球からのFluoroGold逆行性標識を併用し、起始核からの投射の詳細な解析を引き続き行うとともに、単一ニューロンレベルで起始核から投射先の嗅球に至る全貌を明らかにするために計画したHistamin-Cre mouseを導入し、アデノ随伴ウイルスAAVを用いた単一ニューロン標識を進めている。これは新型コロナウイルス感染拡大により、海外からの導入の手続きは停滞したため昨年度は導入出来なかったが、導入後は動物飼育は順調に行われ、単一ニューロン標識も既に着手している。これは昨年度から予定通り進捗した。
この他、レーザー顕微鏡および超高圧電子顕微鏡による独自の定量解析により以前より解析を進めた嗅球内GABAニューロンのGABA免疫反応の多様性を明らかにし、更にこの多様性と遠心性ニューロン投射との関連性が示す結果を得つつある。これは当初予期していない知見で、今後大きく研究が進展する可能性が示唆され、当該研究において大きな意味を持つ。
以上の現状の進捗から、概ね順調に進展している、あるいは予期せぬ発展につながる状況といえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
5HT、Ach、NAの３種のニューロンについて、嗅球における線維分布、varicosityとシナプスの形態と数について層別の更に詳細な解析を行う（共同研究者・堀江）。またシナプス結合の三次元構造と定量解析を進める（共同研究者・清蔭）。
Hisニューロンについては、嗅球からのFluoroGold逆行性標識を併用し、起始核Tmnからの投射の詳細な解析を行い、Tmnの組織構成の中でのHisニューロンの局在と細胞構成について解析を勧める（研究代表者・樋田、共同研究者堀江）。更に、単一ニューロンレベルで起始核から投射先の嗅球に至る全貌を明らかにするため、Histamine-Creマウスとアデノ随伴ウイルスベクター（AAV）を用いた単一ニューロン標識を解析する（共同研究者・清蔭）。
また同時に、最近明らかにしている嗅球GABAニューロンのGABA発現の多様性（Satoh K et al 2020）とこれら遠心性投射ニューロンの線維分布と近接度、投射パターンとシナプス結合との関連をレーザー顕微鏡と超高圧電子顕微鏡を組み合わせた形態計測と定量解析を進める。
上述のように、研究は順調に予定以上に進捗し、また最近得られた知見（GABAニューロンのGABA発現の多様性）と本研究知見との関連性が考えられたことから、当該研究を更に遂行しつつ、今後の研究展開へつなげたい。
なお、報告者らの研究成果は、英国のDr. Time Viney, Prof. Peter Somogyi（Department of Pharmacology, University of Oxford）の注目を受け、メール交信の結果、嗅球への遠心性投射調節の生理学的解析の共同研究へ発展することになった。新型コロナウイルス感染拡大により年度内に実施は難しくなったが、当研究の最新地検を形態学的基盤に次年度において共同研究を実施したい。
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| Causes of Carryover |
当該研究が順調に進捗したことから、本研究成果がいち早く、英国のグループ（Dr. Tim Viney, Prof. Peter Somogyi, Department of Pharmacology, University of Oxford）に注目され、メールを通じての討論の結果、生理学的検証を目的に、共同研究者と共に渡英・滞在し、当該研究を形態学的基盤として電気生理学的実験を英国において行う計画を立てた。しかし、新型コロナウイルス感染拡大により実施は延期をせざるを得ず、その応分の額を次年度使用額として生じた。
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| Remarks |
本研究の成果に関しては、申請者が代表の川崎医科大学解剖学ホームページに随時発表する。http://www.kawasaki-m.ac.jp/anatomy/
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