2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K06941
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| Research Institution | University of Miyazaki |
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Principal Investigator |
若園 佳彦 宮崎大学, 医学部, 助教 (90377755)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
緑川 良介 宮崎大学, 医学部, 助教 (20470320)
高宮 考悟 宮崎大学, 医学部, 教授 (40283767)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | N型糖鎖修飾 / AMPA受容体 / 全反射蛍光顕微鏡 / 一分子動態観察 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
糖鎖修飾は、その多様性に加え、機能解析があまりにも煩雑であるため体系的な研究はほとんどなされていない。最近、我々の研究室では、AMPA型グルタミン酸受容体（AMPA受容体）のサブユニットの一つであるGluA1の糖鎖修飾が細胞膜への発現制御に関与することを報告したが、詳細なメカニズムについては未だ不明のままである。そこで本研究では、細胞内におけるAMPA受容体の合成から分解までの素過程を追跡することによりその解明を目指す。
細胞イメージング法は、細胞を“生きたまま”の状態で、その微細構造や分子動態のリアルタイム観察を可能にする。細胞膜におけるAMPA受容体は動的平衡状態にあり、集団分子として捉えた場合、その挙動は平均化されたものとなるため、その分子動態を詳細に検討するためには個別分子の挙動を捉える必要がある。そこで一分子レベルでの動態解析が可能な全反射蛍光顕微鏡（TIRF）法を用いる。
本研究計画は、①観察（TIRF）システムの構築、②蛍光標識された標的分子（AMPA受容体）の作製、③①と②を用いての実際の観察に大別され、今年度は①のTIRFシステムの構築を試みた。
市販の倒立型蛍光顕微鏡の励起用水銀ランプの光源を取り外し、代わって青色レーザー光をダイクロイックミラー、対物レンズへと導入した。その際、対物レンズからの射出光を平行光とするため、凹凸レンズを用いて、青色レーザー光の焦点を対物レンズの後側焦点面に合わせた。光軸を対物レンズの中心からズラすことにより、射出光は傾き、異なる媒質の境界面ではやがて全反射となる。本計画では高開口数（NA=1.65以上）の対物レンズを用いて、この全反射光を作り出す予定であったが、高開口数の対物レンズの入手の遅れにより、現在、通常の対物レンズを用いた斜光照明により実験を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
高開口数（NA=1.65以上）の対物レンズの入手の遅れにより、現時点では、通常の対物レンズを用いた斜光照明のため、観察（TIRF）システムを最適化するための十分なブラッシュアップを行えていない。
光学システムはほぼ現行のままで使用可能であるため、現在使用中の対物レンズを近々入手予定の高開口数の対物レンズと交換し、若干の微調整を行えば全反射照明を作り出すことは可能と考える。しかしながら、一分子レベルでの観察を行うためには、光学系に依拠するsignal/noise比（S/N比）を抑える必要があることから、さらなるブラッシュアップは必要と考える。さらに、一分子レベルの微弱蛍光の観察では、撮像システム（カメラ）の性能に依拠する部分も大きいことから、より高性能のカメラの購入も検討している。
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| Strategy for Future Research Activity |
GFPを蛍光タグとしたGluA1（GFP-GluA1）では、小胞体でのGFP-GluA1の蓄積のため、背景光が増加し、signal/noise比（S/N比）を低下させることから、一分子観察は困難であることが知られている。そこで、この問題に直面した場合、以下の２つの方策を駆使することにより一分子動態解析のための条件の最適化を図る。それでもなお解決が困難な場合は、ZsGreenやHalo7などの他の蛍光プローブの使用の検討を試みる。
①GFP-GluA1の発現量の調節
HEK293T細胞への遺伝子導入に際して、cDNA発現ベクターの量を調節することにより小胞体に蓄積するGFP-GluA1の発現量を抑え、背景光を減弱させる。但し、小胞体中のGFP-GluA1もまた観察対象であることから、極端な発現抑制は控える。
②FRAP（光退色後蛍光回復）法の適用
強い励起光を照射することにより蛍光（背景光）を退色させ、その後に現れる新たな蛍光シグナルを追跡する。
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| Causes of Carryover |
本研究計画を遂行するためには、微弱蛍光が取得可能な撮像システム（CCDカメラ）が必要不可欠であると判断した。そこで、当該年度の予算の一部を繰り越し、次年度の予算と合算することにより新規に購入することを考えている。
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