新規シナプス御機構：細胞外イオン濃度の活動依存的変化が果たす機能的役割の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06945
• Research Institution: Keio University
• Principal Investigator: 荒井 格 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (00754631)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 松田 恵子 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (40383765)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 小脳 / デルタ型グルタミン酸受容体 / 細胞外カルシウム濃度 / 長期可塑性 / 小脳性運動学習 / Dセリン / シナプス伝達

Outline of Annual Research Achievements

小脳平行線維（PF）―プルキンエ細胞（PC）シナプスに局在するδ2型グルタミン酸受容体（GluD2）について、①同シナプスの長期可塑性（LTD）に必須であること、②特に幼若期において同シナプスの活動に応じてバーグマングリアから放出されるDセリンとの結合がLTD誘導すること、③近年の構造解析からDセリン結合部位近郊にCa結合部位があり、Dセリンに対する親和性に影響することから、PF-PCシナプスの間隙の神経活動依存的なCa動態がDセリン依存性LTDの新規制御機構である可能性がある。本研究は、この可能性について神経回路レベルだけでなく個体行動レベルでの解明を目指す。
本年度は、まず前年度から進めていた、GluD2のCa結合能を操作したノックイン（KI）マウス（KI）とDセリン分解酵素であるDAOを欠落させたノックアウト（KO）マウスの交配を行い、得られた個体から順次視機性眼球反応（OKR）を使った行動実験を行った。DAO KO下で2点変異を導入してCa結合状態を模倣したKI（dKI）マウスと野生型を比較したところ、dKIマウスでは野生型よりも成績が下がる傾向を示した（①）。一方、DAO KO下で1点変異を導入してCa結合能を欠落させたKI（sKI）マウスと野生型マウスを比較したところ、有意な差が生じない傾向が示された（②）。①の結果については、前年度の電気生理学的実験の結果（dKIマウスでは、長期可塑性が抑制される）と一致した。一方、②の結果については一致しなかった（sKIマウスでは、長期化阻止が亢進する）が、これは。DAOのホモ個体では、Dセリンの濃度が十分に高いためにCa結合能の相違が結果に反映されにくい可能性が考えられた。そこで、DAOのヘテロとsKIマウスを交配させて再度実験する計画を立て、交配を開始した。現在得られた個体から順次行動実験を開始する予定である。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、主にGluD2に変異を導入したKIマウスを使った行動実験を計画していたが、当初計画していた実験についてはある程度遂行することができた。ただし、結果については必ずしも期待するものが得られた訳ではなかったが、その原因解明に向け、既に次の実験を計画している。
dKIを使った実験では、前年度に実施した電気生理学的実験で得られた所見と一致する所見が得られた（電気生理学的実験で、Dセリン依存性LTDの抑制が見られたのに対し、OKRを使った行動実験でも学習成績の低下傾向が見られた）。一方、sKIを使った実験では前年度の電気生理学的実験結果と必ずしも一致しなかった（電気生理学的実験ではLTDの更新が見られたのに対し、行動実験では野生型と変わらない傾向を示した）。この点については、DAO-KOマウスにおいて細胞外Dセリン濃度が相対的に高すぎることが原因と予測を立て、それを検証すべくDAO-ヘテロマウスの作製に取り組んでいる。DAOヘテロマウスでは、細胞外のDセリン濃度がKOと野生型の間くらいにあると期待でき、これをbackgroundとするマウスでは、GluD2のsKIと野生型の間で行動実験で有意な差が出る可能性が期待できる。既にDAO-ヘテロマウスとGluD2-sKIマウスの交配を開始しており、次年度行動実験を本格的に進める予定である。

Strategy for Future Research Activity

最終年度である2021年度は、まずDAO-ヘテロをbackgroundに持つGluD2のsKIマウスを使った行動実験を行い、2019年度に得られた電気生理学的実験の所見と一致する結果が得られるかどうかを検討する。また、DAO-KOをbackgroundにもつGluD2のdKIマウスを使った行動実験も引き続き行い、PF―PCシナプス間隙のCa動態によるDセリン依存性LTDの制御機構の個体レベルでの機能的意義を明らかにする。
次に、PF-PCシナプス間隙のCa動態の計測を行う。低親和性Caセンサーをシナプス間隙に局在するタンパクを足場に局在さる。Caセンサーは、近年報告があったG-CEPIA (Nat Commun. 2014)を利用する予定である。Kd = 0.6 mMと、シナプス間隙のCa濃度（～1.2 mM）の測定に最も近い。G-CEPIAをシナプスに局在するタンパク質（例えばPSD-95やGluD2等）に融合させたキメラタンパク質を作製し、過剰発現によってPF-PCシナプス間隙にCaセンサーを局在させる。これに成功できれば、次にCaイメージング実験に取り組むが、まず比較的簡単な実験系として小脳の初代培養細胞を使って行う。これに成功すれば、次に急性スライス標本を作製し、本研究で遂行してきた電気生理学的実験と同じ条件下でのCa動態を定量化する。可能であれば、更にin vivoにおけるCa動態の定量化を目指す。
以上の実験を中心に必要な実験を適宜行い、学術論文としての発表を目指す。

Causes of Carryover

今年度は主に行動学的実験を行い、代わりに当初予定していた電気生理学的実験を減らした。その結果、電気生理学的実験に必要な消耗品費の費用を削減でき、当該助成金が発生した。これについては、次年度分として請求した助成金と合わせて使用する予定である。具体的には、電気生理学的、行動学的実験、更にCaイメージング実験に必要な動物、その飼育資材、また実験に必要な試薬等の消耗品の費用を拡充する予定である。