2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of higher central nervous circuits involved in inducing of psychological stress responses using by real-time multiple fiber-photometry
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19K06954
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
片岡 直也 名古屋大学, 医学系研究科, 特任助教 (20572423)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 心理ストレス / 交感神経 / 神経回路 / ファイバフォトメトリ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心理ストレスは動悸や体温上昇といったストレス反応を引き起こすとともに、自律神経失調症や心因性発熱、心的外傷ストレス症候群（PTSD）の原因となる。しかしながら、心理ストレスによる反応や病態を引き起こす神経回路基盤には不明な点が多い。ストレス疾患の病態解明が進まない原因として、複雑な脳内ネットワークの解析が困難であることや、心理ストレスの種類や強度によってストレス疾患の表現型が様々に変化することが挙げられ、その解析の難しさに拍車をかけていると考えられる。
研究代表者は心理ストレス反応を引き起こす神経経路の探索を行う中で、前頭前皮質腹側部（vmPFC）の神経細胞群が、ストレス信号を統合する視床下部背内側部（DMH）へストレス信号を伝えることで、心理ストレス性の交感神経反応を惹起することを見いだした。前頭前皮質の背側部（dmPFC）はこれまでストレス反応を抑制する脳領域であることが報告されており、背側部と腹側部でストレス反応に関わる役割が正反対であることが示唆された。研究代表者は、前頭前皮質より上位に位置する多数の神経核が複雑な神経ネットワークを形成し、相互に神経活動のバランスを制御することで心理ストレス反応の強弱を決定していると予想し、ストレス反応を惹起する腹側部と、ストレス反応を抑制する背側部のそれぞれに入力する上位の神経ネットワークの全容を明らかにする。複数の脳領域で構成される神経回路ネットワーク全体のバランスを捉えるために、神経細胞の活動をin vivoで多点光計測するマルチファイバフォトメトリを導入し、ストレス反応と神経伝達路の活動相関を捉えることでストレス神経回路の全貌解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度は、前頭前皮質へストレス信号を入力する脳領域の組織化学的同定を行う予定であった。vmPFCとdmPFCのそれぞれへ逆行性神経トレーサー（CTb）を注入してこれらの領域に投射する神経細胞群を標識した上で、ラットにストレスを与え、神経の活性化マーカーであるc-Fosの発現を調べ、ストレス信号を入力する上位脳領域を同定する計画であった。まず本実験では、vmPFCへCTbを注入したラットへ心理ストレスを与え、心理ストレス信号をvmPFCへ入力する脳領域の探索を行った。その結果、情動に関与する神経核やストレスホルモンの受容に関与する神経核などにおいてCTbでラベルされた神経細胞にc-Fosが発現していたことから、これらの脳領域が心理ストレス信号をmPFCへ入力していることが示唆された。引き続き、dmPFCへストレス信号を入力する脳領域の同定を行う。
本研究計画では、マルチファイバフォトメトリのセットアップの構築も行った。当初、GCaMP6などの緑色蛍光Ca２＋プローブの検出には、当研究室に設置済みのレーザー光源を用いる予定であったが、強い励起光では緑色蛍光Ca２＋プローブによる神経活動の変化を観察する事が困難になることが明らかとなったことから、レーザー光源に換えて、より安価で光出力が弱いLED光源を採用し、装置へ組み込んでいる。現在、マルチファイバフォトメトリのセットアップを制御するためや、画像解析を行うためのMATLABスクリプトが一部正常に動作しないトラブルに見舞われている。今後は、改めてスクリプトの内容の確認と、各種デバイスとの接続を再確認することでファイバフォトメトリを正常に稼働させる。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度については、vmPFCへストレス信号を入力する神経核から、視床下部背内側部へ投射するvmPFCニューロン群への入力を調べるため、GCaMP6mを発現させるAAVrgをvmPFCへ注入し、jRGECO1（赤色Ca２＋プローブ）を発現させるAAVrgをDMHにも注入することで、DMHへ投射するvmPFCニューロン群とvmPFCの上位の脳領域の両方の神経活動を同時計測する。現在構築しているマルチファイバフォトメトリのセットアップはGCaMP6mの計測に特化しているため、GCaMP6mが発現している神経細胞の活動しか観察することが出来ない。そこで本研究では、GCaMP6mとjRGECO1の同時記録を可能にするため、カメラと光ファイバーの間にイメージスプリッターを導入し、カメラへ２色の蛍光を別々に半分に分けて投影する。このイメージスプリッター内部へ光ファイバーから得られた蛍光を分離する光学フィルターを導入することで、GCaMP6mとjRGECO1の２色の神経活動の変化を同時に取得し解析をおこなう。得られた神経活動の時系列データの相互相関係数（ｒ）を元にシャフリング解析を行い、神経細胞間の接続関係を調べる。さらに、vmPFCからDMHの神経伝達の他にdmPFCからDMHへの神経伝達も知られている。今後はdmPFCにおいてもvmPFCと同様に上位の脳領域の解析を行い、vmPFCへ入力する脳領域との違いを明らかにする。そして、これらの解析から得られた結果をとりまとめ、成果の発表を行う。
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| Causes of Carryover |
2019年度の予定では、前頭前皮質へストレス信号を入力する脳領域の組織化学的同定を行う予定であったが、前頭前皮質の中でもvmPFCへストレス信号を入力してくる脳領域の同定にとどまっている。今後dmPFC についても同様の実験を行いdmPFCへストレス信号を入力してくる脳領域の同定を行う。また、マルチファイバフォトメトリのセットアップに関して、上述の通り、MATLABスクリプトが一部正常に動作しないことから、その確認作業に時間をとられてしまい進捗に遅れが生じ、次年度使用額が生じた。
次年度はMATLABスクリプトを再度確認し、早急にマルチファイバフォトメトリのセットアップを完成させ、vmPFCもしくはdmPFCへストレス信号を入力する脳領域の神経細胞の活動を計測する。
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