2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of higher central nervous circuits involved in inducing of psychological stress responses using by real-time multiple fiber-photometry
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19K06954
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
片岡 直也 名古屋大学, 医学系研究科, 特任講師 (20572423)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 心理ストレス / マルチファイバフォトメトリ / ストレス反応 / 交感神経反応 / 神経回路網羅的解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
心理ストレスは動悸や体温上昇といったストレス反応を引き起こす。しかしながら、心理ストレスによる反応や病態を引き起こす神経回路基盤には不明な点が多い。ストレス疾患の病態解明が進まない原因として、複雑な脳内ネットワークの解析が困難であることや、心理ストレスの種類や強度によってストレス疾患の表現型が様々に変化することが挙げられ、その解析の難しさに拍車をかけていると考えられる。
研究代表者は心理ストレス反応を引き起こす神経経路の探索を行う中で、前頭前皮質腹側部（vmPFC）の神経細胞群が、ストレス信号を統合する視床下部背内側部（DMH）へストレス信号を伝えることで、心理ストレス性の交感神経反応を惹起することを見いだした（Kataoka et al., 2020）。前頭前皮質の背側部（dmPFC）はこれまでストレス反応を抑制する脳領域であることが報告されている。代表者は、前頭前皮質より上位に位置する多数の神経核が複雑な神経ネットワークを形成していると予想し、ストレス反応を惹起する腹側部と、ストレス反応を抑制する背側部のそれぞれに入力する上位の神経ネットワークの全容を明らかにする。複数の脳領域で構成される神経回路ネットワーク全体のバランスを捉えるために、神経細胞の活動をin vivoで多点光計測するマルチファイバフォトメトリを導入し、ストレス反応と神経伝達路の活動相関を捉えることでストレス神経回路の全貌解明を目指す。神経回路の活動変化と、熱産生や血中ストレスホルモン濃度の変化などとの連関を網羅的に捉えることで、心理ストレス反応の発現に関わる高次中枢神経ネットワーク機構を明らかにすることを目的とする。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
昨年度、当初カメラやLED光源の制御をMATLABで行う計画であったが、制御不能となるトラブルが続発したため、LED光源を別のメーカーの物と換装し、LEDとsCMOSカメラの制御を同一ソフトウェア上で行える仕様に変更した結果、励起光の照射と光強度の微調整、ならびにカメラによる撮影が問題無く行えることが確認できた。
vmPFCへ入力する神経細胞群へGCaMP6を選択的に発現させるため、当初の計画では逆行性にGCaMP6 を発現させるAAVをvmPFCへ注入し、神経活動を観察する予定であったが、逆行性AAVを注入した脳組織を用いた免疫組織化学実験の結果、GCaMP6s の発現量にばらつきがあることや、目的神経細胞群にGCaMP6sが発現しないことが明らかとなった。そこで、本研究計画ではvmPFC へcre を発現させる逆行性AAVを注入し、vmPFC へ入力する神経細胞群の複数箇所の領域へloxP 配列でGCaMP6sを挟んだAAVを注入し、GCaMP6sが発現させる方法に変更を行った。続いて、上記の方法を利用し、GCaMP6を導入したマウスへ直径400 um の光ファイバーカニューラを留置したマウスの作製を行った。このマウスの頭部へパッチケーブルを接続したマウスへ社会的敗北ストレスを与え、ストレス暴露前、攻撃中、ストレス後０分、５分、１０分後のそれぞれのタイミングで各脳領域の神経活動の同時記録を行っている。現在、マウス脳の複数箇所へ光ファイバーカニューラを留置することで、マウス個体への負荷が高くなることで術後に死亡する個体があることから、マウスへ負担の少ない直径200 umの光ファイバーカニューラを留置したマウスを準備し、LED光源側の励起光強度を若干上げた条件でのGCaMP6s観察が可能となるか検討を行っている。これらを踏まえ研究が予定よりも遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
現在、vmPFCへストレス信号を入力すると予想される複数箇所の脳領域から神経活動を同時記録することが可能になったことから、今後はvmPFC が上位の脳領域から受けた出力トーンを視床下部背内側部（DMH）へ伝える神経反応を観察するためDMHへ投射するvmPFCニューロン群への入力を調べるため、GCaMP6sを発現させるAAVrgをvmPFCへ注入し、jRGECO1（赤色Ca２＋プローブ）を発現させるAAVrgをDMHにも注入を行う。この実験を行うことで、DMHへ投射するvmPFCニューロン群とvmPFCの上位の脳領域の両方の神経活動を同時に計測することが可能となる。
上記の神経ネットワーク解析の結果、同定したvmPFCの上位の神経細胞群のうち、最もストレス反応への寄与が大きいと考えられる細胞群へ青色光で神経細胞の活動を抑制するiChloC やiC++ を導入することで神経路選択的に光抑制し、ストレスで惹起される自律生理反応（体温・血圧・脈拍の変化やストレスホルモン分泌など）にどのような影響が生じるかを調べる計画である。また、神経活動取得のための光ファイバーが動物の動きを制限することから、ファイバカニューラとバンドルファイバに用いる光ファイバーの直径を200 umに変更し、光ファイバーの軽量化を行う計画である。これらの成果をまとめ、成果の発表を行う。
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| Causes of Carryover |
本研究計画は、前頭前皮質へストレス信号を入力する脳領域を対象にマルチファイバフォトメトリを用いてカルシウムイメージング並びに、脳領域同士の接続解析を行う予定であった。しかしながら、セットアップを行ったマルチファイバフォトメトリのシステムを制御するMATLABスクリプトが正常に動作しなかったことから、この問題の解決に大きな時間を費やしてしまい、研究計画の進捗に遅れが生じ、次年度使用額が生じた。現在は画像取得方法やカメラ制御方法についてMATLABを介さない方法に変更することで、vmPFC へストレス信号を入力する複数の脳領域の神経活動の同時記録に成功している。今後は、この情報を基にDMHの神経活動にどのような影響を与えるか詳細な解析を行い、vmPFCへストレス信号を送る複数の神経路から主要な神経路の同定を計画している。これらの実験から得られた新たな知見を国内外の学会で発表するため、未使用額をこの旅費へ振り替える。また、残額は、現在進行中の実験に必要なウイルスベクター作製や、行動実験に必要な機器のセットアップに要する消耗品の購入に使用する。
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Research Products
(4 results)
