2019 Fiscal Year Research-status Report

Effects of molecular hydrogen on ischemic brain injury

Research Project

Project/Area Number	19K06960
Research Institution	Keio University
Principal Investigator	梶村眞弓慶應義塾大学, 医学部(日吉), 教授 (10327497)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	菱木貴子慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (10338022) 久保亜紀子慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 助教 (50455573)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	分子状水素 / 脳虚血 / エネルギー代謝 / 質量分析イメージング / Neurovascular coupling
Outline of Annual Research Achievements	ガス分子は, 高分子の構造内に比較的容易に浸透し, 金属原子や鉄-硫黄クラスターを有する補欠分子族への結合や, 低分子の官能基に特異的に結合することにより生物活性を発揮する。ガス分子の作用は, 可逆的・即効的でかつ複数の標的をもつことを特徴とするが, それ故に, 複数のガス分子とその受容蛋白質が時空的に複雑な相互作用を形成する生体内において, ガス分子の生成・受容及び情報伝達機構と生理作用との因果関係は十分に立証されていない。 “Time is brain”の言葉が示す通り, 脳梗塞は可能な限り早期の治療開始が原則であるが, 脳梗塞の治療法は少なく, 治療の開始が間に合わず, 神経症状が増悪することが多々ある。マウスの脳梗塞モデルにおいて, 水素ガスの吸入により神経機能障害が改善されることが示された10年を経た。しかしながら, 水素ガスの受容体・情報伝達機構と生理作用との因果関係は十分に立証されておらず, 臨床応用を展開するにあたり大きな障壁となっている。本研究は, 脳虚血病態における水素ガスの標的分子・受容機構を探究し, エネルギー代謝の代償機転の分子機構を解明することを目的とする。本研究においては「低分子から高分子に働きかける」metabolic regulation of geneticsを推進し, 従来の分子生物学的手法である「高分子から低分子へ」攻めていくgenetic regulation of metabolismとは逆向きの戦略をとることで, 「水素吸入がなぜ効くのか」の分子基盤を徹底的に解析し, 臨床医学研究への橋渡しを目指す。その第一歩として初年度は, 偏在性の脳虚血動物モデルの確立, 水素ガスの投与条件の検討, さらに脳組織のメタボローム解析を実施した。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 【目標：水素ガスの標的分子の探索】研究初年度は, 分子状水素（H2）で特異的に作動するレセプタの分子実体を洗い出すためのリライアブルかつ再現性のある実験系の構築に傾注した。第一に水素ガス吸入のタイミング, 投与時間を, 脳梗塞モデルマウスで検討した。虚血直後に1.3%H2を90分間（単回投与）吸入させ, 2週間にわたるロータロッド, ハンギングワイヤー等の機能テストを実施したところ, 顕著な改善を認めた。また梗塞巣の縮小（虚血3日後）も認められた。代謝解析を進めるにあたり適切である実験条件が担保できた。まず時間軸を, MCAO後30分, 再灌流後60分の2点に限定し, Non-targeted analysis であるmetabolome実験系を用い, 虚血の度合いに呼答して領域特異的に惹起される代謝リモデリングを水素投与群と対照群で比較した。現在までに, 水素ガスで酵素活性の修飾が起こる複数の標的酵素が同定できている。
Strategy for Future Research Activity	我々が開発した定量的質量分析イメージング法を武器に, 皮質, 海馬, 基底核などの解剖学的な領域, あるいは, コア, ペナンブラといった血流低下に伴った虚血病態に特異的に形成される領域で惹起される代謝リモデリングを, in situで経時的に解析する。低分子代謝物や細胞内メディエータの時空間的な偏在・定量情報・機能（「いつ, どこで, どれくらい, どのようにはたらくか」）を捉えることで, 水素ガスがどの酵素の活性を修飾するのかを探り出す。また, 初年度で洗い出した水素ガスの候補標的分子の精製酵素を用い分子メカニズムを探究し, 虚血時のredox managementをはじめとする代償機転の分子機構の糸口としたい。
Causes of Carryover	メタボローム解析に必要な標準試薬やカラムのストックが予想以上にあり, それを超える試薬の購入をせずとも実験が遂行できたため, 支出が抑えられた。そのため次年度繰り越し額が発生した。今年度は昨年度得られたメタボローム解析の結果に基づいて, 絞り込んだ代謝物のin vivo imagingを施行予定である。そのための、matrixやと導電性のスライドガラス等の消耗品および、解析用のPC等を購入予定である。