2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of new drug delivery systems utilizing covalent dynamic bonds between boronic acids and cell surfaces
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19K07015
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| Research Institution | Josai University |
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Principal Investigator |
江川 祐哉 城西大学, 薬学部, 准教授 (90400267)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | インスリン / フェニルボロン酸 / 徐放性製剤 / シアル酸 / 細胞表面接着 / 血糖値 / 赤血球凝集 / 動的共有結合 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度はボロン酸と細胞表面糖鎖との動的共有結合を利用したドラッグデリバリーシステム（DDS）として，徐放性製剤の可能性を調査した。ボロン酸と細胞表面糖鎖との結合は動的共有結合であるため，ボロン酸を修飾した薬物は，細胞表面への結合と解離を繰り返しながら徐々に血中に移行すると期待される。薬物としてはインスリン（Ins）を用い，そのアミノ基に4-カルボキシフェニルボロン酸をアミド結合でつなぎ，フェニルボロン酸修飾Ins（PBA-Ins）とした。
PBA-Insの細胞表面への結合力の有無は，赤血球の凝集の様子で評価した。赤血球凝集反応は，レクチンで引き起こされる。これはレクチンが4量体であり，レクチンが複数の赤血球と相互作用して，赤血球同士を架橋することで起こる。PBA-Insは1分子に複数のPBAが修飾されており，赤血球同士を架橋できる可能性がある。検討を行う中で，赤血球を800倍希釈した系において，PBA-Insによる赤血球凝集が見られた。また，PBA部位と結合するフルクトースを共存させることで，PBA-Insによる赤血球凝集が抑制されたことからも，PBA部位が赤血球の凝集に関与していることが確認された。
PBA-Insの徐放性は，糖尿病モデルラットに投与し，血糖降下作用の持続の様子で評価した。PBA-Insを静脈内投与すると，未修飾のInsと比較して，血糖降下作用が持続することが確認された。以上の結果は，PBA修飾薬物による徐放性製剤の一例と考えられる。
しかし，PBA-Insを静脈投与ではなく皮下投与した場合，その血糖降下作用は著しく減弱した。これは，PBA-Insと皮下組織が結合することにより，PBA-Insの血流への移行性が減弱したためと考えられた。一般的にIns製剤は皮下投与で用いられるため，実用化を目指すには皮下投与でも血糖降下作用が見られるようにボロン酸部位を工夫する必要があると思われた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2019年度ではPBA-Insを調製し，その細胞結合性を評価する試みとして，赤血球凝集反応を用いた。検討開始当初，赤血球を数倍程度希釈したものを用いていたが赤血球凝集を見ることはできなかった。これは赤血球に対しPBA-Insの濃度が低すぎたためと考えられた。PBA-Insは溶解度が低く，使用した濃度（0.17 mM）より大幅に濃度を上げて使用することは困難であった。そこで，赤血球をさらに希釈することとし，800倍に赤血球を希釈したところでPBA-Insによる赤血球凝集反応を再現性良く観察することができた。また，凝集が見られる条件にフルクトースを共存させることで凝集が抑制された。これはフルクトースがPBAと結合力を持つため，PBA部位と細胞表面糖鎖との結合に競合しているためと考えられた。本検討を通してPBA修飾薬物と細胞の結合性を調査できる評価系を構築できた。またフルクトースなどの競合物質の影響についても評価できる可能性を示せた。
PBA-Insの徐放性については，糖尿病モデルラットを用いて行った。Wistarラットにストレプトゾトシンを投与することにより糖尿病を誘発させた。この糖尿病モデルラットの頸動脈にカニュレーションを行い，そこからPBA-Insを投与した。また，一定時間ごとにカニューレより採血し血糖値を測定した。未修飾のInsも同様に投与し比較したところ，PBA-Insのほうが未修飾Insよりも血糖降下作用が持続する結果が得られた。一方，PBA-Insを皮下投与した場合には血糖降下作用が著しく減弱した。これは，皮下組織においてPBA部位と細胞との相互作用が強すぎ，血中への移行が遅すぎるためとも考えられた。したがって，皮下投与で利用可能なボロン酸修飾Insを設計するには，PBA部位の修飾数を減らす，あるいは結合力の弱いPBA部位に置き換えるなどの工夫が必要と考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本研究では，ボロン酸と細胞との動的共有結合を利用した新しいDDSを作ることを目的としており，2019年度には「ボロン酸の動的共有結合を利用した徐放性製剤」の一例を示すことができた。また，もう一つのDDSとして「ボロン酸の動的共有結合を切断する刺激応答性製剤」の検討も既に開始している。修飾するボロン酸としては，ボロン酸フェニルメトキシカルボニル（BPmoc）基を用い，これをInsのアミノ基に修飾することができた。2020年度はこのBPmoc-Insを用いた血糖値応答性製剤の検討を中心に行っていく。
生体にBPmoc-Insを投与した場合，ボロン酸部位の結合力により細胞表面と結合し血中への移行が抑制され，血糖降下作用を示さないものと考えられる。ここにBPmoc-Insと併用してGOxを投与する。GOxは生体においてグルコースを酸化すると同時に過酸化水素を発生する。過酸化水素がBPmoc-Insのボロン酸部位と反応すると，引き続きBPmoc基の脱離反応が生じて，Insが再生すると期待される。過酸化水素は血糖値に応じた量が発生するため，血糖値に応じたInsが再生すると考えられる。
このBPmoc-InsとGOxを含む血糖値応答性製剤を実現するため，2020年度は以下の検討を行う予定である。まず，BPmoc-Insを過酸化水素と共存させ，Insへと再生するかMALDI-TOF MSを用いて調査する。続いて，BPmoc-Ins，GOxおよびグルコースを共存させた条件でも同様にInsへの再生を評価する。MALDI-TOF MSの検討の後，in vivoの実験を行う。BPmoc-InsとGOxを含む製剤を投与し，糖尿病モデルラットの血糖値変化を観察する。比較としてGOxを含まないものを投与し，想定しているメカニズムの検証も行う予定である。
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Research Products
(3 results)
