2019 Fiscal Year Research-status Report
Construction of innovative strategy for selecting improved antibody fragments as the platform generating next-generation diagnostic reagents
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19K07021
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (80572966)
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (20299085)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 診断薬 / 抗体 / 一本鎖Fvフラグメント / 遺伝子工学 / ファージ提示 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在の診断用抗体は、動物を免疫して得られる天然の抗体であるため、目的に適う抗体が得られない場合も多い。そこで、抗体の「試験管内親和性成熟」が期待されている。対象となる抗体を低分子量の一本鎖Fvフラグメント (scFv) に変換し、その遺伝子にランダムあるいは部位特異的な変異を導入したのちファージ粒子の表面に発現させる。得られる変異型scFv提示ファージのライブラリーから、標的抗原に対して優れた結合能を示す変異体をパンニング (固定化抗原を利用するアフィニティ抽出) により単離するものである。しかし、実際には十分な選択効率は得られず、希少な改良型変異体を見逃すことも少なくない。限られた量の固定化抗原に対して、ごく少数の改良型変異体が大過剰の改悪型変異体と競合することが原因と考えられる。その抜本的な解決法として「クローンアレイプロファイリング (CAP) 法」を考案した。変異抗体の遺伝子で形質転換した大腸菌クローンから産生されるファージの反応性を、マイクロプレートを用いて個別にプロファイリングするものである。各ウェル内で産生されるファージは、提示しているscFvの抗原親和力に応じて予めプレートに固定化された抗原に捕捉され、生物発光検出される。試みに、下垂体副腎系疾患の診断マーカーであるコルチゾール (CS) に対する変異scFvライブラリーを作製し、その一部をCAP法に付したところ、野生型 scFv [Kaは3.8×10E8 (1/M) ] に比べ、32－63倍も向上した変異体が計5種も得られた。これらを用いてCSの競合 ELISAを行ったところ、大幅な高感度化 (50%置換値で11－25倍) が達成された。対照実験として同一ライブラリーの100%を従来のパンニングに付したが、得られた変異体のKaは最大でも野生型の5倍に過ぎず、これらを用いたELISAの感度の上昇は、評価に耐えないものであった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
上記 (5. 研究実績の概要) のように 高親和力変異scFvの発見に関するCAP法の有用性が如実に示され、本法の根幹である戦略の妥当性を支持する結果が得られた。本法は自動化に適する原理でもあり、ライブラリーの100% が解析可能となった場合, 数十を超える高親和力scFvが一挙に得られるものと期待される。しかも、CAP法で単離された変異scFvのアミノ酸配列は、パンニングで得られたものとは異なる特徴を示し、今後のより合理的な変異導入を計画するうえで有用な情報が得られている。抗体の抗原結合特異性・親和性に関与する重要な部分構造は、H鎖およびL鎖の可変部 (すなわちVHおよびVLドメイン)、しかも各々3カ所ずつ存在する相補性決定部 (CDR) とされている。しかし、CAP法由来の親和力成熟scFvでは、抗原と直接接触する可能性は低く、親和性成熟を目的とする変異の導入部位としては顧みられなかった VHドメインN末端の枠組み配列 (FR) 1に少数のアミノ酸置換あるいは挿入が見られた。そこで、部位特異的にFR1のアミノ酸配列をランダム化、あるいは1～6残基のアミノ酸を挿入したライブラリーを作製して、CAP法で検索した。その結果、期待どおり、Kaが 20－35倍程度も向上した変異体を10種以上も得ることができた。この成績は、CAPの抜本的な選択効率ゆえに得られたものと考えられる。このように、本研究課題は、いまのところ順風満帆と言って差支えない状況である。
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| Strategy for Future Research Activity |
上記のように、高親和力変異抗体フラグメントの創製におけるCAP法の効果は顕著である。いまのところ、個々のscFv提示ファージ産生菌を用手法で個別にマイクロウェルに播種しているため、全ライブラリー構成菌の1～3%程度について検索するのが作業の上限である。今後は、ライブラリー全体を検索すべく、各工程の自動化を図る。また、より自動化に適する変法を考案する。そして、これまでその莫大な多様性が生じるために改良変異体の探索が困難であったVHのCDR3 (元来、アミノ酸配列の多様性が最も大きく、抗原への親和力や特異性の発現に最も重要な役割を演じる) をランダム化したライブラリーからの高親和力抗体の単離に応用したい。
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| Causes of Carryover |
ほとんどの額を使用したが、補助金を有効活用するため、次年度使用額とすることとした。
次年度に必要となる試薬を購入することで、有効に使用する計画である。
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[Journal Article] Seeking high-priority mutations enabling successful antibody-breeding: systematic analysis of a mutant that gained over 100-fold enhanced affinity2020
Author(s)
Oyama Hiroyuki, Kiguchi Yuki, Morita Izumi, Yamamoto Chika, Higashi Yuka, Taguchi Miku, Tagawa Tatsuya, Enami Yuri, Takamine Yuriko, Hasegawa Hanako, Takeuchi Atsuko, Kobayashi Norihiro
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Journal Title
Scientific Reports
Volume: 10
Pages: 4807
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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