2021 Fiscal Year Annual Research Report
Construction of innovative strategy for selecting improved antibody fragments as the platform generating next-generation diagnostic reagents
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19K07021
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 准教授 (80572966)
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (20299085)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 診断薬 / 抗体 / 一本鎖Fvフラグメント / 遺伝子工学 / ファージ提示 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
診断用抗体として、遺伝子操作による改変抗体に期待が寄せられている。天然型抗体を一本鎖Fvフラグメント (scFv) に変換したのち可変部に様々な変異を導入し、生じる多様な変異体の分子集団 (ライブラリー) の中から望みの抗原結合能を獲得した改良分子種を選択・単離することにより得られる。その効率を飛躍的に高めるために、新規な選択法、コロニーアレイプロファイリング (CAP) 法を独自に開発し、希少な改良型抗体を網羅的に単離する道を開いた。前年度はコルチゾールに対する変異scFvのライブラリーの検索に適用し、極めて良好な結果を得た。今年度は、エストラジオール (E2) に対するscFvの親和力の改善に応用し、やはり満足すべき成績を得ている。すなわち、マウス抗E2抗体のVHとVLの両ドメインを連結して作製した野生型scFv (Ka, 8.6×E+7 1/M) のVH相補性決定部3 (VH-CDR3;構造上多様性が高く、抗原結合能の発現に重要な役割を演じる) 内の15アミノ酸を系統的にランダム化した。生成する変異scFvの集団をファージ提示し、親和性成熟変異体をCAPで検索することにより、結合定数 (Ka) を野生型scFvのそれより90倍増大させる変異モチーフ (E100eN-I100fA-L100gQ) を見出した。この変異をもつscFvのVLドメインに先に我々が見出した変異モチーフ (I29V/L36M/S77G) を加えたところ、野生型scFvより372倍も高いKa (3.2×E+10 1/M)を示す変異体が得られた。このKa値は、これまでに報告された抗E2抗体の結合定数として最高である。本変異体を用いることで、極めて高感度なE2のELISA (検量線のIC50値4.5 pg、検出限界0.78 pg) が可能であった。以上の成果はすでに学術雑誌に投稿済みである。
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[Journal Article] NanoLuc luciferase as a suitable fusion partner of recombinant antibody fragments for developing sensitive luminescent immunoassays2021
Author(s)
Oyama Hiroyuki, Kiguchi Yuki, Morita Izumi, Miyashita Takayuki, Ichimura Akiyoshi, Miyaoka Hiroko, Izumi Aki, Terasawa Sayaka, Osumi Natsumi, Tanaka Hiroki, Niwa Toshifumi, Kobayashi Norihiro
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Journal Title
Analytica Chimica Acta
Volume: 1161
Pages: 238180-238180
DOI
Peer Reviewed
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