2019 Fiscal Year Research-status Report
がん間質領域に選択的な悪性度指標の磁気共鳴診断法の開発
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19K07023
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| Research Institution | Sojo University |
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Principal Investigator |
竹下 啓蔵 崇城大学, 薬学部, 教授 (70175438)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
國安 明彦 崇城大学, 薬学部, 教授 (90241348)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マトリックスメタロプロテアーゼ / がん / 電子スピン共鳴 / スピンラベル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、血管新生の盛んながんで高発現するマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の活性をin vivoで電子スピン共鳴（ESR）により評価できるプローブの合成を行った。MMP活性を指標にがんの悪性度の診断法を開発するためである。
(1)スピンラベルペプチドの合成：既報でMMP-2感受性ペプチドを検索し、PVGLIGの配列によるヘキサペプチドを選択した。固相FMOC法で伸展したペプチドのN-末端にさらにスピンラベル剤3-カルボキシ-PROXYLを結合させた。スピンラベルペプチドを切り出し、逆相系分取用HPLCで複製生物を分離して、質量分析とESR測定で目的ペプチドを確認した。
(2)スピンラベルペプチド結合カルボキシメチルデキストランの合成：スピンラベルペプチドとカルボキシメチルデキストランを縮合剤EDC存在下で反応後、未反応カルボキシ基をエタノールアミンでブロックし、エタノール沈殿により目的物を回収した。エタノール沈殿の回収率が1割以下と低く、未反応物の除去法を今後検討する必要があった。また、結合率もグルコース残基：スピンラベル=176：1とかなり低かった。
(3)合成プローブのESRスペクトル：MMP活性は、プローブがMMPにより切断されることによりESRシグナルがシャープになることを指標とするため、合成したプローブのESRシグナルの線幅を確認した。プローブの水溶液を測定したところシャープな3本線となり、未反応のスピンラベルペプチドと区別がつかなかった。可能性としてi)未反応のペプチドが混在している、ii)スピンラベルペプチド結合カルボキシメチルデキストラン自身のシグナルが十分ブロード化していないと言ったことが考えられ、今後検討する必要があった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
計画では、初年度にマトリックスメタロプロテアーゼ 活性プローブと酸素分圧プローブのそれぞれプロトタイプを合成することになっていたが、前者の合成に手間取り、両プローブのプロトタイプ合成に至っていない。
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| Strategy for Future Research Activity |
マトリックスメタロプロテアーゼ （MMP）活性測定プローブ：前年度、回収率が悪く、さらにESRシグナルのブロード化が起こらなかったことについて、再度スピンラベルペプチド結合カルボキシメチルデキストランを合成し、未反応物除去法と濃縮法を検討する。具体的には、あらかじめ限外ろかで未反応物除去と濃縮を行ったのちエタノール沈殿で精製する。これにより、未反応物の徹底除去と回収率の向上を図り、前年度の課題を達成する。未反応物を徹底除去した後もESRシグナルがブロード化しない場合は、結合させる高分子のサイズや材質を変えて、ブロード化する条件を探す。ESRシグナルがブロード化するプローブが合成できれば、MMP-2の作用でシャープになるか否かを確認する。
酸素分圧プローブの開発：トリチルラジカルを既報により合成し、デキストランへの結合を検討する。
動物実験による評価：目的プローブが合成できたならば、腫瘍モデルマウスを用いて有効性を評価する。
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| Causes of Carryover |
目的化合物の合成に手間取ったため思うように進まず、さらに未反応物の除去と回収率の向上を目的とした限外ろ過装置（40万円～80万円；機種のスペックによる）の選定に時間を要したため次年度への繰越金を生じた。次年度は、合成に必要な試薬類、器具類、学会出張旅費に加え、限外ろ過装置の導入に使用する計画である。
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