がん間質領域に選択的な悪性度指標の磁気共鳴診断法の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07023
• Research Institution: Sojo University
• Principal Investigator: 竹下 啓蔵 崇城大学, 薬学部, 教授 (70175438)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 國安 明彦 崇城大学, 薬学部, 教授 (90241348)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: マトリックスメタロプロテアーゼ / がん / 電子スピン共鳴

Outline of Annual Research Achievements

前年度までに、スピンラベルしたマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）の基質ペプチド（PVGLIG）をポリエーテルアミンを介してスチレンマレイン酸共重合体（平均分子量1600; SMA）に結合させ、さらにウシ血清アルブミン（BSA）と複合体形成させることにより、MMPの作用でESRシグナル強度の増加を確認できる試薬（SL-PVGLIG-SMA/BSA）を作ることができた。本年度は、合成した試薬のMMP特異性の確認とMMP基質としての評価を行った。
(1) MMP阻害剤の影響：MMP-2とMMP-9に対する2種の阻害剤（(2R)-2-[(4-biphenylsulfonyl)amino]-3-phenylpropinic acidおよび(2R)-2-[(4-biphenylsulfonyl) amino]-N-hydroxy-3-phenylpropionamide）共存下でSL-PVGLIG-SMA/BSAに対してMMP-2とMMP-9を作用させたところ、いずれの阻害剤存在下においてもESRシグナル強度の増加は全く見られなくなった。
(2) 基質ペプチドに対する特異性の確認：PVGLIGの代わりにスクランブルペプチド（GIVGPL）を用いてSL- GIVGPL-SMA/BSAを合成した。これについてMMPの作用を調べたところ、MMP-2、MMP-9いずれの場合にもESRシグナルの増加は見られなかった。
(1), (2)の実験結果から、SL-PVGLIG-SMA/BSAはMMPに特異的に応答することが確認された。
(3) MMP基質としての性質：Lineweaver-Burkプロットより求めた特異性定数（kcat/Km）は、同じペプチドをDDSに利用した抗がん剤の報告値より1オーダー低く、基質として改善の余地が残された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

初年度にマトリックスメタロプロテアーゼ活性評価プローブの検討に時間を要したことに加え、新型コロナウイルス感染症の拡大で思うように実験ができなかったため。また、酸素プローブの合成には至っていない。

Strategy for Future Research Activity

マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）によるESRシグナルの変化をより大きくするためにタンパク質（ウシ血清アルブミン）に直接スピンラベルペプチドを結合させることを検討する。PVGLIGとポリエーテルアミンの間にCysを入れ、マレイミド-スクシイミドによる架橋剤でタンパク質のLysのε-アミノ基と結合させる。タンパク質への直接結合であることに加え、ポリエーテルアミンを介さないため、スピンラベル部位の動きがより制限されてESRシグナルがブロード化し、MMPにより切れた後の尖鋭シグナルとの区別がより明確になることが期待される。この成績を確認した上で、細胞系、動物系へと実験を進める。

Causes of Carryover

初年度からの研究の遅れにより研究の進捗が全体的にうしろにずれ込んだことに加え、2021年度は大学業務（学生の学年担任業務）の多忙な時期と重なったこと、新型コロナウイルス感染拡大の影響で卒業研究の学生の実験が思うように進まなかったことにより繰越金が生じた。
次年度以降、繰越金はマンパワー確保のための学生アルバイト雇用、細胞培養実験に関わる培地や試薬の購入、およびマウスの購入に充てる計画である。