2019 Fiscal Year Research-status Report
単一生細胞内ミトコンドリア質量分析法の開発とミトコンドリオミクスの実現
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19K07028
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
水野 初 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (30457288)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
佐々木 崇光 静岡県立大学, 薬学部, 客員共同研究員 (20382674)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ミトコンドリア / メタボロミクス / 質量分析 / 1細胞分析 / 誘導体化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
細胞内に存在するミトコンドリア内の代謝物を選択的に分析するミトコンドリオミクスを実現するため、2019年度はミトコンドリア局在プローブの開発、およびミトコンドリア成分の高感度・高精度質量分析法の開発を中心に行った。
まずミトコンドリア局在プローブを用いた代謝物分析の有用性を検証した。培養細胞に本プローブを投与し、蛍光顕微鏡観察によりミトコンドリアへの移行を確認後、UVAを照射することでプローブとミトコンドリア代謝物を反応させた。これらの細胞抽出液をLC/MS/MS分析した結果、ピークのm/z値とMS/MSフラグメントからプローブが結合したと考えられるピークが3,000本ほど検出された。これらの中には、α-ケトグルタル酸やユビキノンなどのTCA回路関連の代謝物が含まれていることから、本プローブにおけるミトコンドリア代謝物分析の有用性が示された。今後はこれらのピーク同定を進めるとともに、反応条件の検討を行いより多くの代謝物が検出できる条件を決定する。
次に、ミトコンドリア内の主要代謝物である有機酸を高感度分析するために、カチオン性官能基を有する試薬による誘導体化を行い、質量分析における高感度化を試みた。誘導体化反応条件およびLC/MS/MS分析条件を検討した結果、α-ケトグルタル酸においては通常の測定に比べて約20倍の高感度化を達成することができた。
これらの研究成果はについて学会発表および論文発表を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ミトコンドリアに局在し、ミトコンドリアに存在する代謝物をラベリングするためのプローブを開発し、その有用性の検証を行った。培養細胞に本プローブを投与し、蛍光顕微鏡観察によりミトコンドリアへの移行を確認後、UVAを照射することでプローブとミトコンドリア代謝物を反応させた。これらの細胞抽出液をLC/MS/MS分析した結果、ピークのm/z値とMS/MSフラグメントからプローブが結合したと考えられるピークが3,000本ほど検出された。これらの中には、α-ケトグルタル酸やユビキノンなどのTCA回路関連の代謝物が含まれていることから、本プローブにおけるミトコンドリア代謝物分析の有用性が示された。
また、ミトコンドリア代謝物を高感度で質量分析するための誘導体化の検討を行った。1細胞質量分析では採取するサンプル量が少ないため、現行の質量分析計では感度が不十分のため検出が難しいという問題がある。これを解決するため、イオン化効率の良いカチオン性官能基を有する誘導体化試薬で細胞内代謝物を誘導体化させ、質量分析の際のイオン化効率を向上させる方法を試みた。モデルとして、ポジティブイオンモードによる質量分析では検出が難しい有機酸のカルボキシル基を誘導体化によりカチオン性官能基をラベル化させ、感度比較した結果、誘導体化無しに比べて20倍以上の感度向上が確認された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の予定として、1細胞質量分析法を用いたミトコンドリアの選択的サンプリング方法及び高感度質量分析法の開発を中心に行う予定である。
１生細胞からのミトコンドリアのサンプリングについては、現在1細胞質量分析のためのサンプリングに使用しているナノスプレーチップの先端口径をさらに細くしたもの(1 um)を作成し、細胞内の微小領域の採取を可能とする。さらに共焦点イメージング観察しながら、ミトコンドリア部位のみを細胞質など他の細胞内成分が混入すること無く採取する方法を開発する。また、今年度の研究により、誘導体化による代謝物の質量分析感度向上が確認されたため、細胞内ミトコンドリアを採取したナノスプレーチップ内で前処理や誘導体化を行い、1細胞内の微量成分の質量分析における高感度検出を目指す。さらに、細胞内にはイオン化を阻害するNaイオンやKイオンなどが多く含まれるほか、誘導体化反応の際に多量の未反応の誘導体化試薬が残存するため、これらを除去する必要がある。そこでチップ内の誘導体化した代謝物を選択的に回収して質量分析を行うため、チップ内で簡易な分離精製することが可能なオンチップ前処理方法の開発を行う。
これらの研究開発を重点的に行うことにより、ミトコンドリオミクスの実現に向けた分析基盤の確立を目指す。
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