2019 Fiscal Year Research-status Report
低分子化合物の超高感度測定を目指す抗メタタイプ抗体の効率的創出システムの構築
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19K07033
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (80572966)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (20299085)
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 抗体工学 / 抗メタタイプ抗体 / ファーージ提示 / サンドイッチELISA |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗原抗体反応を用いる分析法は、簡便で多検体の同時処理が可能なため様々な分野で重用される。とくにサンドイッチ法は異なる2種類の抗体を用いることで感度・特異性ともに高く、イムノクロマト法や抗体アレイ法などにも用いられる。しかし、低分子化合物（ハプテン）への適用はその分子サイズゆえに原理的に困難であった。このため競合法での測定に依存せざるを得ず、感度に制約が生じる。申請者は、原発性アルドステロン症などの高血圧性疾患のバイオマーカーとして有用なアルドステロン（Ald）をモデルハプテンとしてとりあげ、Ald-抗Ald抗体複合体を認識する抗体の探索を試みた。複合体を認識する抗体の作製は、動物を免疫する在来法では、体内で複合体が解離するため困難を極める。そこで本研究では、変異抗体のライブラリーからファージ提示法を活用して、新規に開発した特異抗体提示ファージの選択法（コロニーアレイプロファイリング法）を用いた。抗Ald抗体をF(ab’)2化してELISAプレートに固定化したのち、培地を添加したウェル内にAld、抗体ライブラリーに由来する大腸菌コロニーおよびヘルパーファージを加えて培養し、抗体提示ファージを調製しつつ複合体との反応性を発光タンパク質であるGaussia ルシフェラーゼ融合抗ファージscFvで検出した。抗体ライブラリーのうち計9398種のコロニーについて調べたところ、10,000カウント以上の発光強度を示すウェルが227種であった。これらの抗体提示ファージのうち良好な反応性を示すクローンについてELISAによりAld-抗Ald抗体複合体に対する反応性を詳細に検討した。その結果、抗Ald F(ab’)2を固定化したウェルにおいて、Ald (100 ng/assay) 存在下で非存在下に比べ約2～3倍高いシグナルを示すファージクローンが7種得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本研究では特異抗体提示ファージの新規選択法を駆使して、ハプテン-抗ハプテン抗体複合体に対する変異抗体を創製することが目的であり、本法の条件設定（固定化抗体の量、添加ハプテン量または培養時間など）やオリジナル変異抗体ライブラリーの創製が2019年度の計画であった。新規選択法の条件設定については計画通りに遂行されたが、得られた変異抗体クローンの抗原結合能は期待していた結果ではなかった。そこで、申請者は既に得られた変異抗体クローンを出発物質とした2次変異抗体ライブラリーの作製に着手し、さらなる抗原結合能の向上を試みている。
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| Strategy for Future Research Activity |
得られた2次変異抗体ライブラリーから第二世代の変異ファージの探索を試みる。また、別のアプローチとして固定化抗体のさらなる低分子化により、標的抗原との結合前後での構造変化が期待できるようなアクセプター分子としてF(ab’)2よりも小さい一本鎖Fvフラグメント抗体（scFv）の活用を検討している。さらに、用いる抗体ライブラリーについても、抗複合体抗体への親和性が報告されているラクダ由来の単一ドメイン抗体ライブラリーの新規作製も視野に入れており、既にプライマーの構築まで完了している。これらのライブラリーやアクセプターの組み合わせにより目的の抗メタタイプ抗体の単離を目指す。
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| Causes of Carryover |
ほとんどの額を使用したが、補助金を有効活用するため、次年度使用額とすることとした。次年度に必要となる試薬を購入することで、有効に活用する計画である。
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