2021 Fiscal Year Annual Research Report
低分子化合物の超高感度測定を目指す抗メタタイプ抗体の効率的創出システムの構築
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19K07033
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
大山 浩之 神戸薬科大学, 薬学部, 准教授 (80572966)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
森田 いずみ 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (20299085)
小林 典裕 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 抗メタタイプ抗体 / scFv / ハプテン / 抗体工学 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、簡便かつ迅速な測定が可能なことから疾患の初期スクリーニングなどに多用されている。このうち、2種類の異なる抗体を用いるサンドイッチ型のELISAは高い感度が得られ、タンパク質抗原の測定に適用されているが、低分子化合物（ハプテン）では分子サイズが小さいため原理的に適用が困難であった。本研究では抗体提示ファージライブラリーから、抗原抗体複合体を認識する「抗メタタイプ抗体」を単離し、ハプテンのサンドイッチアッセイへの応用を目指した。研究開始当初はIgG抗体を固定化していたが、目的の複合体を認識しない非特異的なファージが多く検出されてきた。この問題を克服するため、人工のミニ抗体であるscFvをとりあげた。本研究では、エストラジオール、コルチゾール、チロキシンを標的抗原とした。また、抗体ライブラリーには、単一ドメイン抗体および抗イディオタイプ抗体にランダム変異を導入したものを用いてスクリーニングを行った。まず、scFvを96ウェルプレートに固定化したのち、各種抗原を加えてインキュベートしたのち培地を添加した。ここへライブラリー由来の大腸菌のコロニーおよびヘルパーファージを加えて培養し、抗体提示ファージを調製しつつ、自作のルシフェラーゼ融合抗ファージscFvにより抗メタタイプ活性を有するファージを発光強度からモニタリングした。各抗原について約1000種ずつコロニーを調べ、発光強度の高いウェルからファージを回収した。これらのうち良好な反応性を示すクローンについてELISAにより抗原抗体複合体に対する反応性を詳細に検討した。その結果、いずれの標的抗原についても10～1000 ngの範囲で用量依存的なシグナルの増大が認められた。今後、これらのクローンにさらに変異を導入することで、より高感度なサンドイッチアッセイの確立が期待される。
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