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2021 Fiscal Year Annual Research Report

低分子化合物の超高感度測定を目指す抗メタタイプ抗体の効率的創出システムの構築

Research Project

Project/Area Number 19K07033
Research InstitutionKobe Pharmaceutical University

Principal Investigator

大山 浩之  神戸薬科大学, 薬学部, 准教授 (80572966)

Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) 森田 いずみ  神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (20299085)
小林 典裕  神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (90205477)
Project Period (FY) 2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords抗メタタイプ抗体 / scFv / ハプテン / 抗体工学
Outline of Annual Research Achievements

抗原抗体反応を利用する免疫測定法は、簡便かつ迅速な測定が可能なことから疾患の初期スクリーニングなどに多用されている。このうち、2種類の異なる抗体を用いるサンドイッチ型のELISAは高い感度が得られ、タンパク質抗原の測定に適用されているが、低分子化合物(ハプテン)では分子サイズが小さいため原理的に適用が困難であった。本研究では抗体提示ファージライブラリーから、抗原抗体複合体を認識する「抗メタタイプ抗体」を単離し、ハプテンのサンドイッチアッセイへの応用を目指した。研究開始当初はIgG抗体を固定化していたが、目的の複合体を認識しない非特異的なファージが多く検出されてきた。この問題を克服するため、人工のミニ抗体であるscFvをとりあげた。本研究では、エストラジオール、コルチゾール、チロキシンを標的抗原とした。また、抗体ライブラリーには、単一ドメイン抗体および抗イディオタイプ抗体にランダム変異を導入したものを用いてスクリーニングを行った。まず、scFvを96ウェルプレートに固定化したのち、各種抗原を加えてインキュベートしたのち培地を添加した。ここへライブラリー由来の大腸菌のコロニーおよびヘルパーファージを加えて培養し、抗体提示ファージを調製しつつ、自作のルシフェラーゼ融合抗ファージscFvにより抗メタタイプ活性を有するファージを発光強度からモニタリングした。各抗原について約1000種ずつコロニーを調べ、発光強度の高いウェルからファージを回収した。これらのうち良好な反応性を示すクローンについてELISAにより抗原抗体複合体に対する反応性を詳細に検討した。その結果、いずれの標的抗原についても10~1000 ngの範囲で用量依存的なシグナルの増大が認められた。今後、これらのクローンにさらに変異を導入することで、より高感度なサンドイッチアッセイの確立が期待される。

  • Research Products

    (4 results)

All 2022 2021

All Journal Article (2 results) (of which Peer Reviewed: 2 results,  Open Access: 1 results) Presentation (2 results)

  • [Journal Article] NanoLuc luciferase as a suitable fusion partner of recombinant antibody fragments for developing sensitive luminescent immunoassays2021

    • Author(s)
      Oyama Hiroyuki、Kiguchi Yuki、Morita Izumi、Miyashita Takayuki、Ichimura Akiyoshi、Miyaoka Hiroko、Izumi Aki、Terasawa Sayaka、Osumi Natsumi、Tanaka Hiroki、Niwa Toshifumi、Kobayashi Norihiro
    • Journal Title

      Analytica Chimica Acta

      Volume: 1161 Pages: 238180~238180

    • DOI

      10.1016/j.aca.2020.12.055

    • Peer Reviewed
  • [Journal Article] The VH framework region 1 as a target of efficient mutagenesis for generating a variety of affinity-matured scFv mutants2021

    • Author(s)
      Kiguchi Yuki、Oyama Hiroyuki、Morita Izumi、Nagata Yasuhiro、Umezawa Naoko、Kobayashi Norihiro
    • Journal Title

      Scientific Reports

      Volume: 11 Pages: -

    • DOI

      10.1038/s41598-021-87501-7

    • Peer Reviewed / Open Access
  • [Presentation] ストレプトアビジン結合ペプチド融合scFvを用いる抗体固定化ELISA系の開発2022

    • Author(s)
      大山浩之, 山越悠可, 池田あさひ, 森田いずみ, 木口裕貴, 小林典裕
    • Organizer
      日本薬学会第142年会オンライン
  • [Presentation] 免疫測定法の高感度化に資する高親和力変異抗体探索システム-Clonal Array Profiling (CAP) 法の構築と応用-2021

    • Author(s)
      木口裕貴, 大澤愛, 平野圭一郎, 反田瞳, 中村仁美, 大山浩之, 森田いずみ, 小林典裕
    • Organizer
      第71回日本薬学会関西支部総会・大会オンライン

URL: 

Published: 2022-12-28  

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