2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of fluorescent probes to investigate copper metabolism and pathological dysfunction based on copper
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19K07035
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
奥田 健介 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (00311796)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
高木 晃 神戸薬科大学, 薬学部, 助教 (00758980)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 銅 / 還元的環境 / 代謝 / 病態 / 蛍光プローブ / 亜鉛 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、がんをはじめとする病態時における銅(I)イオンの挙動が注目を集めている。このような生体における銅(I)イオンの役割を解析するツールとして種々の蛍光プローブが開発されてきたが、これらプローブの多くがホスト・ゲスト相互作用に基づくキレーター型分子であるために細胞内銅(I)イオンシグナルに干渉する。また、化学反応に基づく発蛍光型プローブも開発されては来たが、これらは酸化的切断反応にもとづき酸素分子を必要とするため、がん微小環境に代表される低酸素環境では感度が低下する。
当研究室では、硫化水素蛍光プローブとして汎用されているアジド型ローダミンのアミンへの硫化水素による還元反応が銅(II)イオン存在下に加速されることを見出している。この反応が硫化水素により銅(II)イオンが還元されて生じた銅(I)イオンがアジド型ローダミンを還元したものと申請者は考えた。そこで、高濃度のグルタチオンが存在し同様に還元的環境下である細胞内夾雑系において、銅(I)イオンを蛍光検出可能な系が芳香族アジドを有する蛍光団をもとにして構築可能であると考えて研究にとりかかった。
まず、硫化水素によるアジド型ローダミンの還元反応におけるo-位の置換基効果の検討を行ったところ、予想通り電子求引性置換基の導入により硫化水素による反応は加速したが、同時に立体障害に敏感であることも判明した。ついで銅(I)イオンを添加したところ、立体障害のない系においてのみ硫化水素による反応が顕著に加速した。本系においてはグルタチオンによる発蛍光反応は予想通り認められなかったが、予期に反して銅(I)イオンを添加したグルタチオンによる発蛍光反応が認められなかった。この結果は、グルタチオンにより銅(I)イオンが完全に捕捉されてプローブとの反応に関与できなくなったためと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初の目的である細胞内夾雑系において有用な銅(I)イオンの高感度蛍光プローブの創製には至らない一方で、銅(II)イオンとの錯体形成ののちに化学反応が進行して蛍光団を放出して蛍光を生じる化合物を見出した。さらに選択性の向上を目指して構造展開を行ったところ、細胞内夾雑系において有用な亜鉛イオン選択的な高感度蛍光プローブの創製に至った。
生体内で亜鉛イオンはDNAポリメラーゼやアルカリホスファターゼなど様々な生命現象を司る酵素の活性中心に利用される必須微量元素である。さらに亜鉛イオンは、神経細胞間でのシグナル伝達やヒスタミン分泌などに関連するメッセンジャーとしても知られ、糖尿病やアルツハイマー病、がんの進展など様々な病態に関わっていることも明らかとなっている。そのため、生細胞や生組織中において亜鉛イオンを高感度・選択的に検知できかつ濃度変化を鋭敏に検知できる蛍光プローブを開発することができれば、亜鉛イオンが関与する病態や生命現象の研究、医薬品開発などにおいて非常に重要な手法となる。本プローブは、既存の蛍光プローブでは検出することのできない低濃度域での亜鉛イオンの挙動解析を必要とする医学薬学研究での解析ツールとして利用でき、広く亜鉛イオンが関わる疾病の治療薬開発研究に寄与するものと期待される。
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| Strategy for Future Research Activity |
１．銅(I)イオン蛍光プローブの創製：次年度においては、すでに確立した亜鉛イオンプローブのさらなる構造展開を行って、銅(I)イオン親和性部位を導入することにより当初の目標である銅(I)イオン蛍光プローブを創製する。銅(I)イオンとの反応性の評価を行い、結果をプローブデザインにフィードバックし、望ましい性質を有する誘導体を選抜する。次いで、in vitro培養細胞系での銅(I)イオン検出実験に適応し、細胞内夾雑系におけるプローブの妥当性を評価する。細胞膜透過性・毒性(WST-8 assayおよびLDH assay)などに問題が認められた場合には、適宜物理化学的なパラメータを考慮した誘導体化を行うことによってプローブの性能向上を図る。
２．細胞内小器官局在性を付与した蛍光プローブの開発：さらに、これまでの研究過程にて選抜された化合物をもとに、細胞内小器官局在性を付与した第２世代のプローブの設計・合成を行う。続いて、亜鉛イオンないし銅(I)イオンとの反応性を評価し、その結果をもプローブデザインにフィードバックさせ、望ましい性質を有する誘導体を選抜する。次いでin vitro培養細胞系に適応し、亜鉛イオンないし銅(I)イオンとの反応性および細胞内小器官への移行性の評価を行いプローブの妥当性を検証する。毒性あるいは細胞内移行性などに問題が認められた場合には、適宜物理化学的なパラメータを考慮した誘導体化を行うことによってプローブの性能向上を図り、分子の最適化を行う。
３．マルチカラーイメージングプローブへの展開：他の小分子生理活性物質とのクロストークを明らかにできるようなマルチカラーイメージングへの展開を見据えて様々な励起・蛍光波長を有する各種蛍光団を有するプローブの設計・合成を行う。合成が完了次第上述の評価系にて検討し、同様に分子の最適化を行う。
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| Causes of Carryover |
380,392円と次年度に繰り越し金が生じた状況としては、本年度に当科学研究費補助金で支出を予定していたCO2インキュベーターとバイオクリーンベンチを他の経費で賄うことができた。そのため、光イメージング研究に必要なルミノメーターの購入を行ったが、当初に見積もっていた金額より安価で購入できた。そのうえ、予定していた学会報告がCOVID-19の蔓延により中止となったため、計上していた旅費を執行するに至らずに、次年度使用額が生じた次第である。計画変更に伴って試薬や機器の購入時期を変更しており、次年度以降に試薬など消耗品の購入を一括して行うことで安価に試薬類を購入できると考えている。
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[Journal Article] Development of Near-infrared Fluorescent Probes with large Stokes shift for Non-Invasive Imaging of Tumor Hypoxia2020
Author(s)
Kensuke Okuda, Bahaa G. M. Youssif, Ryosuke Sakai, Takahiro Ueno, Takayuki Sakai, Tetsuya Kadonosono, Yasuyuki Okabe, Ola I. Abdel Razek Salem, Alaa M. Hayallah, Mostafa A. Hussein, Shinae Kizaka-Kondoh, and Hideko Nagasawa
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Journal Title
Heterocycles
Volume: 101
Pages: 559-579
DOI
Peer Reviewed / Open Access / Int'l Joint Research
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