2019 Fiscal Year Research-status Report
膜タンパク質の膜貫通領域におけるシステイン残基を介したレドックス感知機構
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19K07040
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| Research Institution | National Institute of Advanced Industrial Science and Technology |
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Principal Investigator |
徳永 裕二 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 研究員 (80713354)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
坂倉 正義 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 助教 (20334336)
鴫 直樹 国立研究開発法人産業技術総合研究所, 生命工学領域, 主任研究員 (20392623)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | システイン / レッドクス修飾 / 膜タンパク質 / NMR / 高分子量タンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、膜タンパク質の膜貫通領域に多く含まれるシステイン残基が、細胞内外のレドックス環境に応じた酸化や硫化（ポリサルファイド化）などの修飾を介してその機能を制御するとの仮説に基づきその実証的研究を行っている。本研究では、酸素の無い環境で作った試料を溶液NMR法にて観測することで、安定に、かつありのままに膜タンパク質のシステイン残基修飾状態を同定・定量する技術の開発を目指している。
令和１年度は、アミノ酸のL-システインに、硫化（-S(S)nH化）を施すことが知られる硫化ナトリウムを添加した試料のNMR観測より、複数種類の硫化成分が不均一に混在する様子を安定かつありのままに観測することに成功した。また、LC-MS測定を行うことにより、当該サンプルにおける主たる硫化成分がCys-SSHであることを同定し、NMRシグナル強度との整合性を得た。これにより、システインの硫化状態をNMRにて同定・定量するための基盤が整った。また、可溶性タンパク質であるユビキチンにシステインを導入した変異体を対象とした同様の実験より、システイン残基由来シグナルの化学シフト変化を観測し、このアプローチがタンパク質にも適用可能であることを確認した。さらに、令和２年度の目標を一部先行し、膜タンパク質であるC99についてはNMRスペクトルを取得するとともに、phospholamban(PLN)については大量発現系の構築まで達成した。以上より、令和２年度には可溶性および膜タンパク質を対象としたレドックス修飾状態のNMR解析に速やかに取り掛かることができる。また、後述するように、本研究の内容と深い関わりのある、高分子量タンパク質のNMR観測技術についての論文１報を、査読付き国際誌に発表した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
初年度に目標とした、遊離アミノ酸L-システインの硫化状態の解析において、不均一かつ複数の修飾成分をありのまま、１日程度の長時間安定に観測することを実現するとともに、硫化状態の主成分を同定することに成功した。これに加えて、可溶性タンパク質であるユビキチンに導入したシステイン残基の硫化剤・酸化剤添加条件におけるNMRスペクトル変化を解析し、タンパク質において同様の解析が可能であることを示した。これらにより、NMRを用いてレドックス修飾の同定・定量を行い、また、レドックス状態のNMR情報基盤を整備するための実験的基盤を構築した。２年度目の目標である膜タンパク質についても、C99の試料調製およびNMRスペクトルの確認、およびPLNの大量発現系の構築を先行して完了し、速やかな目標達成に向けた準備を着実に整えている。さらに、膜タンパク質はミセルまたは脂質膜中に再構成するため、実効的な分子量が100 kDaを超え溶液NMRの感度が著しく低下するという問題があるが、この問題を解消する独自技術として、15N直接観測CRINEPT法を新たに開発した。この技術を用いて医療用抗体のNMR観測を行い、その高次構造状態や糖鎖修飾状態の評価における有用性を示した論文を、J Med Chemに発表した（doi:10.1021/acs.jmedchem.0c00231）。本技術は、室温換算した実効分子量として300 kDaの高分子量タンパク質の主鎖アミドシグナルを、重水素化を行うことなく観測可能であることから、発現難度の高い膜タンパク質にも幅広く適用可能な基盤的技術である。以上のように、初年度に目標とする実験データを取得し、２年度目の内容を一部先行して達成したことに加えて、膜タンパク質を含め幅広い応用範囲を持つ基盤技術についても独自開発・発表を行ったことから上記区分とした。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和２年度には、令和１年度に構築した、溶液NMRによるシステインアミノ酸および可溶性タンパク質のレドックス修飾解析技術を論文化し、査読付き国際誌に発表する。また、この技術を膜タンパク質に適用する。膜タンパク質としては、令和１年度にサンプル調製およびNMR測定の準備を整えたC99およびPLNを用いる。C99については、膜貫通ヘリックス上で脂質膜側を向いているアミノ酸残基を中心に、Cys残基に置換した変異体８個の発現コンストラクトを作製済みである。これらを対象として、硫化ナトリウムを添加した条件におけるNMRスペクトルを測定することで、細胞膜からの深さやシステイン周辺のアミノ酸配列がレドックス修飾効率およびC99の立体構造に与える影響を定量的に解析する。PLNについては、野生型の配列にて膜貫通領域に3個含まれるシステイン残基が、膜近傍にて生成する硫化水素により硫化されることで、心臓を保護する活性の上昇に寄与することが知られている。本課題では、NMR法を適用することでこの構造的機構を明らかとする。具体的には、硫化剤を添加した条件における、不均一かつ効率が異なることが想定される3個のシステイン残基の修飾状態を、ありのままに区別して定量するとともに、当該修飾がPLNの運動性を含めた立体構造に与える影響を解析する。これらのことにより、膜中でのレドックス修飾による膜タンパク質の機能制御機構を立体構造に基づき解明し、論文発表する。なお、可溶性タンパク質についても、レドックス修飾をはじめとした細胞内環境の変化に基づく機能的構造変化を解析し、成果を発表する予定である。
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| Causes of Carryover |
B-Aに相当する4円で決済可能な物品、試薬、その他の案件は見出しがたく、概ね申請した通りの額を使用したと認識している。翌年度には、今年度に使い残した4円を最大限に活用し、初年度を上回る成果を挙げる予定である。
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