2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K07048
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| Research Institution | University of Shizuoka |
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Principal Investigator |
山崎 泰広 静岡県立大学, 薬学部, 講師 (80415330)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 性差 / コレステロール胆石症 / 胆汁分泌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
コレステロール胆石症は、コレステロール過飽和により生じた結石によって引き起こされる疾患であり、女性に好発することが知られている。胆石症発症には胆汁脂質成分の不均衡が引き金となるため胆汁分泌能の性差が重要であるが、その詳細については解明されていない。本研究では、in vivoによる胆汁分泌能の測定とオミックス解析を組み合わせることにより、胆汁分泌能の性差が胆石症発症率の差を生み出す可能性について検討した。
我々は2019年度の両側卵巣摘出術（OVX）マウスを用いた実験から、卵巣ホルモンの欠如は胆汁中への胆汁酸分泌を減少させることを見出している。2020年度はこの現象が起こるメカニズムを解明するために、高脂肪食で飼育した偽手術群（sham）とOVX群から肝臓を摘出し、胆汁分泌関連遺伝子の発現について比較した。その結果、shamマウスと比較して、OVXマウス肝臓における脂質トランスポーター遺伝子群の有意な減少がみられた。また、これらトランスポーター群の発現誘導に関わる核内受容体FXR及びLXRの減少が確認された。脂質トランスポーターの機能異常は胆汁中のコレステロール過飽和を惹起し、胆石形成の引き金になると報告されている。以上の結果は、閉経期女性におけるコレステロール胆石症発症率の増加に、脂質トランスポーターの機能異常が関与する可能性を示している。
また、胆石症発症性差を惹起する因子について探索するために、マウス新生児における肝発現遺伝子の雌雄差をDNAマイクロアレイにより解析した。その結果、毛細胆管の形成に重要な働きを持つ細胞骨格分子の一部に雌雄差があることが見出された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
2020年度の結果から、OVXにより卵巣ホルモンが欠如したマウスでは肝毛細胆管膜に存在する脂質トランスポーター、中でも胆汁酸トランスポーター・Abcb11の遺伝子発現が顕著に減少することを見出した。またこれら遺伝子の発現調節に関わる核内受容体LXR、およびFXRも減少していることを見出した。この結果は卵巣ホルモンの不足により核内受容体FXRの発現が減少すること、それにより胆汁酸分泌トランスポーター・Abcb11の遺伝子が減少し、胆汁酸分泌能が不十分となる可能性を示唆している。さらに肝毛細胆管膜を分画し、実際にタンパク質レベルの減少を確認する予定であったが、COVID-19の影響により十分なデータがとれなかった。また同様に、男性ホルモンが胆汁分泌に与える影響を調べるために精巣摘出（ORX）マウスを解析する予定であったが、これも実現できなかった。
また遺伝的性差が胆汁分泌に与える影響を調べるため、8.5日齢のマウス肝臓を採取し、DNAマイクロアレイにかけることで雌雄の発現遺伝子の違いを調べた。同腹から雌雄それぞれ3匹の肝臓を摘出し、得られたmRNAからcDNAを合成した後、3匹分を混合してサンプルとした。その結果、8.5日齢では毛細胆管の形態維持に重要な細胞骨格分子に性差があることを見出した。この結果を踏まえ、新生児期における毛細胆管の発生に雌雄差があるか確認するために、8.5日齢の組織化学的な解析を試みた。切片を作成し、アクチンフィラメント染色の手技検討までは行ったが、実際の解析はCOVID-19の影響によりかなわなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの結果より、卵巣ホルモンが不足すると、胆汁分泌に関わる脂質トランスポーターの遺伝子発現、特に胆汁酸トランスポーター・Abcb11が減少すること、これに伴い胆汁酸分泌が抑制されることを見出した。本年度は、この減少がタンパク質レベルで起こっているのか、また毛細胆管膜への局在化にどのような影響を及ぼしているかについて調べる。具体的には、OVX群、およびsham群のそれぞれの肝臓から毛細胆管膜画分をショ糖密度勾配遠心法により調製し、ウェスタンブロットによりトランスポーター分子の発現量を定量する。またOVXマウス、shamマウスの肝臓それぞれに蛍光タンパク質融合トランスポーター遺伝子をin vivo導入し、遺伝子産物の動態を観察することにより、卵巣ホルモンがトランスポーター分子のトラフィキングに与える影響について調べる。併せて精巣ホルモンが胆汁分泌に与える影響についても、精巣摘出術を施したマウスを用いることで、胆汁分泌能、および関連タンパク質の発現レベルの両面から解析する。
DNAマイクロアレイを用いた結果から、胎生17.5日齢の段階で胆汁酸合成・輸送に関する雌雄差があったこと、また8.5日齢の解析から毛細胆管膜の形成に関与する細胞骨格分子に雌雄差があったことから、発生の段階で胆汁分泌能に違いがある可能性が示唆された。よって本年度は、胎児期から新生児の毛細胆管発生の雌雄差について、免疫組織学的手法により調べる。発見された雌雄差がコレステロール胆石の発生に寄与するかについて考察する。成体として8週齢マウスの雌雄差、おより食事による遺伝子発現の違いについても同様にDNAマイクロアレイで解析する。特に脂質トランスポーターの細胞内トラフィキングに関与する遺伝子の違いについて重点的に解析する予定である。
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| Causes of Carryover |
COVID-19により、卵巣摘出術による脂質トランスポータータンパク質の発現量、および発現分布への影響を解析することができなかったため、一連の実験に使う予定であった動物、およびその飼育費、タンパク質解析用の試薬、分子生物学的試薬、免疫組織試薬は次年度に購入する。また、成体マウスにおけるマイクロアレイ解析とその検証もできなかったので、これも次年度に購入する。
大学異動に伴い追加で購入が必要な器具・機器が発生したため、その購入に使用する。
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