コレステロール胆石症発症性差の解明

2022 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K07048
• Research Institution: 湘南医療大学
• Principal Investigator: 山崎 泰広 湘南医療大学, 薬学部医療薬学科, 准教授 (80415330)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2024-03-31
• Keywords: 性差 / コレステロール胆石症 / 胆汁分泌 / 胆汁酸生合成

Outline of Annual Research Achievements

コレステロール胆石症はコレステロール結石が胆道を閉塞することにより引き起こされる疾患であり、40代以降の女性に好発することが知られているが、そのメカニズムは不明である。コレステロール結石は胆汁中の脂質成分比が変動することにより発生するため、胆汁脂質分泌能の性差は発症性差を解明する鍵となる。本研究では、in vivoによる胆汁分泌能の測定とオミックス解析を組み合わせることにより、胆汁脂質分泌能の性差が胆石症発症率の差を生み出す可能性について検討した。
8週齢同腹の雌雄マウス肝臓からtotal RNA を抽出し、DNA マイクロアレイ による網羅的遺伝子発現解析を行ったところ、雌優位な遺伝子にはコレステロール・胆汁酸合成関連遺伝子が多く含まれていた。この雌雄差はホルモンや環境の影響が少ないと考えられるE17.5、およびP8.5の肝臓では見られなかったことから、染色体由来の性差ではなく、性ホルモンや環境に依存する性差である可能性が示唆された。さらに肝毛細胆管膜画分を用いた解析から胆汁酸トランスポーター・ABCB11が雌の毛細胆管膜で高発現していること、また胆汁酸の胆汁分泌能は雌で有意に高いことから、雌ではコレステロール・胆汁酸の合成能、および胆汁酸の胆汁分泌能が高く、コレステロール結石がむしろ発生しにくい状態であることを見出した。同様の実験を高脂肪食負荷したマウスを用いて行った結果、コレステロール・胆汁酸合成系の雌優位な遺伝子発現は見られず、ABCB11の毛細胆管膜でのタンパク質発現量は雌雄差が逆転していた。この結果は、過栄養化状態では、雌の方がコレステロール胆石を発生しやすい状態であることを示唆しており、過栄養状態に対する適応力の違いがコレステロール胆石症の発症性差につながる可能性が示唆された。

Current Status of Research Progress

4: Progress in research has been delayed.

Reason

一昨年に新設の湘南医療大学・薬学部に移籍したが、コロナ禍の影響で校舎の完成が遅れた関係で動物実験を行う環境が整わず、研究の遂行が滞った。そのため、2022年度は前職の静岡県立大学で行ったデータの再検証を中心に行った。
遺伝的性差が胆汁分泌に与える影響を調べるため、8週齢のマウス肝臓を採取し、DNAマイクロアレイにかけることで雌雄の発現遺伝子の違いを調べた。同腹から雌雄それぞれ3匹の肝臓を摘出し、得られたmRNAからcDNAを合成した後、3匹分を混合してサンプルとした。本実験は普通食群、および胆石症モデルである高脂肪食（高コレステロール、高コール酸含有）摂餌群それぞれ行い、普通食群では雌の方がコレステロール・胆汁酸合成系遺伝子の発現が多いが高脂肪食摂餌によりこの差が消失することを見出した。胎生17.5日齢や8.5日齢のマウス肝臓を用いたDNAマイクロアレイの解析から、普通食群における性差は染色体由来というより性ホルモンが関与する可能性を見出したが、どの性ホルモンが違いを生み出しているかについての検証までは進行できなかった。
また胆汁脂質成分や毛細胆管膜画分の分析から、胆汁酸トランスポーター・Abcb11が胆汁分泌の性差を生み出している可能性を見出した。Abcb11の機能は毛細胆管膜への移行と細胞質への取り込み、つまり細胞内トラフィキングにより制御されているため、蛍光タンパク質標識Abcb11をマウス肝臓に発現させ、その動態を解析することを予定していたが、新しい職場での環境が整わず実現できていない。

Strategy for Future Research Activity

現在、コロナによる新校舎完成の遅れにより研究に必要な条件が揃っていないため、まずは必要な器具・試薬を早急に準備し、動物実験ができる環境を整える。
これまでの研究により、健常時、雌は雄に比べて胆汁酸合成能、および分泌能が高いためコレステロール結石発生はむしろ抑えられているが、過栄養状態ではこれが逆転し雌で胆石が発生しやすい状態になっている可能性が示唆された。本実験結果をさらに検証するために、マイクロアレイで雌雄差のあったコレステロール・胆汁酸合成系の遺伝子をRT-PCR法により定量比較する。また、胎児や新生児肝臓を用いたDNAアレイの結果から、胆汁酸合成能や分泌能の雌雄差に性ホルモンが関与する可能性が示唆されたため、性腺摘出術を施したマウスを用いた検証を行う。
コレステロール胆石発生には、コレステロールの可溶化に必須である胆汁酸の濃度低下が重要であると言われている。これまで、胆汁酸トランスポーターであるABCB11の遺伝子発現に雌雄差はないが、高脂肪食負荷による毛細胆管膜でのタンパク質発現変動に違いがあることを見出しており、胆石発生の性差メカニズムにABCB11が重要である可能性が高い。ABCB11は細胞内トラフィキングによる細胞膜への移行や細胞質への取り込みにより活性が制御されているため、性差による発現分布の違いを免疫組織化学的手法により解析する。さらに雌雄マウスの肝臓それぞれに蛍光タンパク質融合トランスポーター遺伝子をin vivo導入し、遺伝子産物の動態を観察することにより、詳細なトランスポーター分子の細胞内トラフィキングを解析する。違いが確認された場合は卵巣摘出マウスを用いて同様の解析を行い、卵巣ホルモンがABCB11の細胞内動態に影響を及ぼすかについて調べる予定である。

Causes of Carryover

コロナによる影響で動物実験施設を含む新校舎の完成が遅れたため、動物実験センター内の整備に時間がかかった。また新設の薬学部のため、動物実験委員会の設置や規定の作成等をする必要があったが、これにかなりの時間を有したため、動物実験がほとんど進まなかった。現在これらの問題は解決されている。